[發明專利]一種短須裂腹魚心臟細胞系的構建和超低溫冷凍保存方法

有效

• 申請號: 201310400091.3
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103409365A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 王曉愛;潘曉賦;楊君興;劉倩;陳小勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一種短須裂腹魚心臟細胞系的構建和超低溫冷凍保存方法，屬淡水水生生物細胞培養和超低溫冷凍保存技術領域。

背景技術：

魚類細胞培養起于20世紀60年代，發展至今形成了一套包括培養基、抗生素、原代培養和傳代培養方法等相對完善的細胞培養體系，截止目前，已建立了280余株細胞系。我國魚類細胞培養歷經30余年，也只建立了50余株魚類細胞系，涉及的種類有約30種，主要以海洋種類為主。從以上事例可以看出，一套成熟的細胞培養技術流程并不是一株細胞系建立成功的必備條件，成熟的技術流程并不能使細胞培養獲得成功，細胞培養仍然需要從提供原代細胞物種本身的生物學特性入手，經過艱苦的野外調查和大量的室內實驗，對細胞培養體系的培養條件進行調整，找到最優的培養條件，才能使細胞培養獲得成功。云南土著淡水魚類近600種，占中國淡水魚類的50%，因此，云南土著魚類種質資源保存顯得尤為重要，但細胞培養研究鮮見報道。

短須裂腹魚Schizothorax?wangchiachii（Fang，1936）隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚亞科(Schizothoracinae)、裂腹魚屬(Schizothorax)，俗名，面魚、細甲魚，主要分布在烏江、金沙江及雅礱江。短須裂腹魚為底棲魚類，一般生活在水流較急的峽谷河流之中，在支流多見于急流沖擊的深潭中，是當地名貴的野生魚類，近年調查結果顯示，雖在其分布區還有一定數量，但其產量已大大降低。2007年云南水產研究所人工繁殖成功，但存在的主要問題是：魚苗魚種十分容易感染小瓜蟲病和水霉病，而且一旦感染就迅速蔓延，尤其是小瓜蟲病極其難治愈，由此導致苗種大量死亡。同時，野外引種個體需要一段時間才能適應塘養環境，而此適應階段是各種疾病的爆發期，造成引種個體死亡。因此，病害防治是短須裂腹魚人工養殖的關鍵問題，而細胞生物學是研究病毒作用機理的有效手段。另一方面，由于養殖魚類本身的局限性，塘養環境下人工繁殖易造成染色體異常，如多倍化和異倍化，需要細胞短期培養用于核型分析以檢測人工繁殖品種的質量。因此，需要研究一種短須裂腹魚細胞系的構建方法，建立短須裂腹魚細胞系。

經文獻檢索，未見與本發明的相同報道。

發明內容：

本發明的目的是提供一種操作簡便易行的短須裂腹魚心臟細胞系的構建和超低溫冷凍保存方法，以滿足對短須裂腹魚種質資源保存和理論研究的需要。

本發明的短須裂腹魚心臟細胞系的構建和超低溫冷凍保存方法，其具體步驟如下：

（1）?制備PBS消毒液和細胞培養液

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素濃度為200IU/ml，鏈霉素濃度為200μg/ml，兩性霉素B濃度為20?μg/ml；

基礎培養液：向M199培養液中加入胎牛血清，使胎牛血清體積占總體積的10%；

原代培養液：向M199培養液中加入胎牛血清、細胞生長因子bFGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，bFGF濃度為10ng/ml，青霉素濃度為150IU/ml，鏈霉素濃度為150μg/ml，兩性霉素B濃度為20?μg/ml；

傳代培養液：向M199培養液中加入胎牛血清、細胞生長因子bFGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，bFGF濃度為6ng/ml，青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為100μg/ml，兩性霉素B濃度為10?μg/ml；?

調節上述培養液的pH值為7.0-7.2，放置于4℃冰箱中保存備用；

（2）?原代培養

以75%的酒精消毒1齡健康短須裂腹魚魚體，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其心臟，置于無菌培養皿中，PBS消毒液清洗心臟組織3次后，用無菌器械剪成組織小塊，然后用2ml?0.2%胰蛋白酶-EDTA消化6?min，用0.2ml胎牛血清中和胰酶反應，1000rpm離心收集心臟組織塊，再在心臟組織塊中加入2ml?0.1%Ⅳ型膠原酶消化1h，1200rpm離心收集心臟組織塊及細胞，原代培養液重懸，并將其接種于25?cm²細胞培養瓶中，于18℃培養箱中啟動原代培養，每三天半量更換培養液，以除去未貼壁的組織和死細胞；

（3）?傳代培養