[發明專利]一種發酵生產L-丙氨酸的高產菌株及其制備方法

在審

• 申請號: 201310399567.6
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103602609A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 黃建坡;苗位云;孟凡會;劉煥書;朱傳厚;韓秀麗;郭志遠;徐龍
• 申請（專利權）人: 淮北新旗氨基酸有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12N15/01;C12P13/06;C12R1/225
• 代理公司: 徐州支點知識產權代理事務所(普通合伙) 32244
• 代理人: 劉新合

1.一種發酵生產L-丙氨酸的高產菌株Lds.0108菌株，保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏號為：CCTCC?NO:?M?2013361。

2.一種如權利要求1所述的高產菌株制備方法，其特征在于，所述的方法包括：以乳酸產生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus?delbrueckii?subsp.?bulgaricus）為出發菌株，活化出發菌→低能離子注入法誘變處理細胞→可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的高產菌株。

3.根據權利要求2所述的高產菌株對制備方法，其特征在于，所述的活化出發菌，包括：將出發菌德氏乳桿菌保加利亞亞種在斜面培養基上42℃培養至對數生長期，用0.85?%的生理鹽水制成菌懸液，1mL菌懸液含菌數約為10⁷，鏡檢菌種健壯且無雜菌后，吸取0.1mL菌懸液均勻涂布于無菌空白培養皿上，無菌風吹干制成菌膜，鏡檢無細胞重疊后，進行下一步。

4.根據權利要求2所述的高產菌株對制備方法，其特征在于，所述的低能離子注入誘變法誘變處理細胞：真空條件下注入的離子為N離子，劑量為1.5×10¹⁴-5×10^16?ions/cm²，能量為15-20keV，脈沖注入，每次注入5s，間隔時間15-40s，注入后用0.5-1mL無菌生理鹽水洗下菌體細胞。

5.根據權利要求2所述的高產菌株對制備方法，其特征在于，所述的可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株：挑選離子注入后的單菌落進行編號，并接種到對應編號的發酵培養基中發酵培養；將所得的發酵液除去菌體后高溫滅菌，加入1.5%瓊脂和0.01-0.05%抑制劑，滅菌后倒平板，并涂布指示菌，置于35-40?℃培養箱中進行培養；選取指示菌生長的平板所對應的編號的突變菌株進行連續傳代培養，通過穩定性試驗，最終得到1株編號為Lds.0108的L-丙氨酸高產菌株。

6.一種發酵生產L-丙氨酸的方法，其特征在于，利用權利要求1所述的保藏號為：CCTCC?NO:?M?2013361的德氏乳桿菌突變株?Lds.0108來生產發酵。

7.根據權利要求6所述的一種發酵生產L-丙氨酸的制備方法，具體步驟包括：

（1）、擴增培養種子液：保藏號為：CCTCC?NO:?M?2013361的德氏乳桿菌突變菌株Lds.0108來生產發酵通過斜面培養和種子罐擴培養，培養溫度37℃，斜面培養時間24h，種子罐培養時間18h；

（2）、厭氧發酵生產L-丙氨酸：將擴增后的種子液接種到發酵培養基中，底物葡萄糖濃度為6-12%，發酵溫度為35-40℃，培養基pH值為6.5-7.5，維持厭氧環境，待殘糖濃度小于0.1%則發酵完成，發酵時間30-52h；

（3）、發酵液凈化處理：先采用陶瓷超濾膜或有機管式超濾膜過濾，然后通過納濾膜進一步過濾；

（4）、制得成品：納濾液經過真空濃縮蒸發去水分，結晶析出L-丙氨酸，經離心分離，干燥得成品。