[發明專利]金黃桿菌及其羰基還原酶用于阿瑞匹坦手性中間體生產

有效

• 申請號: 201310399109.2
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103497911A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 吳中柳;劉艷;湯脫險;裴小瓊
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/53;C12N9/04;C12P7/22;C12R1/01
• 代理公司: 成都賽恩斯知識產權代理事務所(普通合伙) 51212
• 代理人: 張帆;肖國華

技術領域

本發明屬于應用微生物與酶工程領域，具體涉及一株金黃桿菌及其基因組編碼的一種新型羰基還原酶，并利用該菌或者這種羰基還原酶作為生物催化劑生產阿瑞匹坦手性中間體。?

背景技術

光學活性(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是Merk公司研發的藥物阿瑞匹坦（Aprepitant，商品名“Emend”）的關鍵手性中間體。阿瑞匹坦的主要功能是預防和治療化療引起的急性或延遲性嘔吐。?

目前制備該手性中間體的主流工藝是化學合成。近年來，隨著生物催化技術的不斷發展，研究者們積極探索采用酶催化前手性酮的方法生產該中間體，篩選到了一些對映體選擇性>99%的微生物菌株，包括Lactobacillus?Kefir、Aspergillus?niger（Tetrahedron：Asymmetry，2006,17,2000-2005），Penicillium?expansum（Tetrahedron：Asymmetry，2009,20,2759-2763），Leifsonia?xyli?HS0904（Appl?Microbiol?Biotechnol,2011,90,1897-1904），氧化微桿菌Microbacterium?oxydans?C3（專利號ZL201010271579.7），以及選擇性稍差的熱帶假絲酵母菌Candida?tropicalis20216（ee值>92%，Tetrahedron,2004,60,789-797）等。但是，這些報道都是以微生物菌株全細胞作為生物催化劑，可轉化的底物濃度較低，目前僅有Leifsonia?xyli?HS0904轉化的底物濃度較高，最高可轉化?的底物濃度為51g/L，30h的轉化率為91.8%（J.Microbiol.Biotechnol.2013,23(3),343-350）。考慮產物分離純化成本問題，這些菌株的轉化能力與實際應用還有較大的距離。?

為獲得高效的前手性酮催化工藝，首先應解決高效高選擇性酶源問題，從環境中篩選新型微生物菌株作為催化劑是常用的有效途徑之一。然而原始菌株直接轉化可能存在安全性、遺傳穩定性問題，原始菌株可能繼續利用醇產物導致產物產量低以及原始菌株內的其他酶可能對底物作用生成副產物等問題，因此將原始菌株的關鍵羰基還原酶基因克隆并異源表達，以重組菌或者酶用于生物轉化則可避免上述問題，且這種催化體系較為簡單，穩定，產物分離提純容易，易于工業化。?

發明內容

本發明的目的是公開一種新篩選的金黃桿菌CA49（Chryseobacterium?sp.CA49），及其所產高活力高對映選擇性羰基還原酶ChKRED20，并利用該菌或者該酶還原底物3,5-雙三氟甲基苯乙酮制備光學純(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，從而以生物催化的方法制備高光學純度的阿瑞匹坦手性中間體。該菌從果園土壤中富集、分離并經過多輪篩選后獲得。關于該菌的保藏信息是：保藏號為CCTCC?M2012484；分類命名為金黃桿菌CA49（Chryseobacterium?sp.CA49）；于2012年11月27日在中國典型培養物保藏中心保藏，地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。?

基于上述發明目的，本發明首先提供一種金黃桿菌CA49（Chryseobacterium?sp.CA49），保藏編號為CCTCC?M2012484）。?

本發明還提供了上述金黃桿菌CA49（Chryseobacterium?sp.CA49）?的篩選方法，所述篩選方法為：于果園采集土樣，以3,5-雙三氟甲基苯乙酮為唯一碳源，經2輪富集篩選獲得可能的產酶菌株。將初篩菌株培養后，以休止細胞為催化劑轉化底物，測定產物生成量和產物對映體過量值，并將產物對映體過量值高的菌株進行進一步的鑒定，得到本發明涉及的金黃桿菌。?

本發明還提供一種上述金黃桿菌CA49（Chryseobacterium?sp.CA49）作為生物催化劑在轉化底物3,5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應用。?

具體地，上述用途的操作方法為：將篩選的金黃桿菌CA49（Chryseobacterium?sp.CA49）培養后，收集菌體，以休止細胞作為催化劑，并添加異丙醇和葡萄糖作為輔酶循環底物，底物3,5-雙三氟甲基苯乙酮經生物轉化后得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，產物的對映體過量值>99%。?