[發明專利]一對特異識別豬NFкBp65基因的多肽及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201310398624.9
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103554231A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 李和剛;趙金山;阮進學;李培培;張寶珣;劉明團;代永聯;侯樂樂;郝小靜;江科;吳海港
• 申請（專利權）人: 青島市畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/11;C12N15/63;C12N15/10;C40B50/06
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技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一對特異識別豬NFκB?p65基因的多肽及其編碼基因和應用。?

背景技術

p65是NFκB轉錄因子最重要的一個亞基。豬NFκB?p65與仔豬藍耳病毒、豬瘟病毒及偽狂犬病毒抗體水平有顯著關聯(Li?et?al.，2011)，其單個氨基酸的改變可引起家豬對非洲豬瘟病毒(ASFV)感染能力的顯著變化(Palgrave?et?al.，2011)。由此可見，豬NFκB?p65基因可作為豬抗病育種的一個重要候選基因。?

p65作為NFκB轉錄因子一個主要的亞基，在哺乳動物免疫反應中扮演著重要的角色。在含有TAD的三個亞基中，p65是唯一一個全身性表達的(Doleschall?et?al.，2007)。p65亞基的缺失導致因肝變性所致胚胎死亡(Beg?et?al.，1995)；相應的，缺失其它四個亞基中任何一個都僅僅導致免疫缺陷，并未表現出任何發育障礙(Gerondakis?et?al.，1999；Li?and?Verma，2002)。與p65在不同細胞中發揮著抗凋亡作用相一致，p65雙敲除的成纖維細胞和巨噬細胞也表現出對TNFα誘導凋亡的敏感度增加(Beg?and?Baltimore，1996；Gerondakis?et?al.，1999)。p65雙敲除的小鼠成纖維細胞永生化速度大大超過正常未敲除細胞(Wang?et?al.，2009)。p65也對正常淋巴細胞的功能起著重要的作用(Gerondakis?et?al.，1999)。NF-κB?p65亞基特異性調節cyclin?D1蛋白的穩定性(Dahlman?et?al.，2009)。p65對IκBβ蛋白的緊密控制在維持細胞動態平衡中是必需的。p65的激活對于細胞死亡和腸上皮的分裂的動態平衡是必需的，同樣在防止重度急性腸炎的發生上也是必要的(Steinbrecher?et?al.，2008)。在腫瘤抑制因子p53存在或缺失的情況下，p65的刪除均可減少K-Ras誘導的肺部腫瘤數量(Basseres?et?al.，2010)。?

另外，豬被認為是異種移植最重要的器官供體。NFκB介導的轉錄激活是引起豬-人異種移植排斥反應的重要原因(Altintas?et?al.，2011；Auchincloss?and?Sachs，1998)，而p65作為NFκB轉錄因子的主要亞基，必然會在這一免疫反應中發揮重要的作用。?

綜上所述，在細胞或個體水平上對豬NFκB?p65基因進行敲除或修飾，可解析豬NFκBp65基因的功能、減緩豬-人異種移植排斥反應或獲得相關疾病模型，為豬抗病育種、異種器官移植及新藥研發服務。?

傳統的基因敲除技術效率很低，因此尋找一種能定點切割豬NFκB?p65基因的技術相當重要。近年來發展的主要方法為依托序列特異的核酸酶進行基因的精確修飾。序列特異的核酸酶主要由一個DNA識別域與一個能非特異性切割DNA的內切酶結構域連接而成。其主要原理為先由DNA識別域識別并結合到需要改造的DNA片段上，然后由與DNA相連的非特異性內切酶結構域對DNA進行切割，造成DNA的雙鏈斷裂(Double-strand?break，DSB)，DSB會激活DNA的自我修復而引起基因的突變從而促進該位點的同源重組。?

轉錄激活子樣效應因子核酸酶(transcription?activator-like?effector?nucleases，TALEN)是繼鋅指核酸酶技術以來的另一種能夠對基因組進行高效定點修飾的新技術。轉錄因子激活效應物家族中有一種蛋白(TALEs)能夠識別、結合DNA。TALE與DNA序列特異性結合主要是由TAL結構內34個恒定氨基酸序列介導。將TALEs與FokI核酸內切酶的切割域相連接，形成TALEN，從而可以實現對基因組DNA雙鏈在特定位點進行修飾。?