[發明專利]雙峰駝特異性抗體制備及免疫檢測方法

有效

• 申請號: 201310397690.4
• 申請日: 2013-09-04
• 公開（公告）號: CN103454413A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 吉日木圖;劉微;玉斯日古楞
• 申請（專利權）人: 吉日木圖;劉微;玉斯日古楞
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

（一）技術領域

本發明屬于抗體工程技術領域，本發明以內蒙古蘇尼特雙峰駝為研究對象，利用牛血清白蛋白（BSA）制備抗BSA的駱駝多抗，優化免疫條件。并制備兔抗駱駝IgG酶標二抗，建立間接ELISA檢測試劑盒。

（二）背景技術

免疫系統分為固有免疫和適應免疫，其中適應免疫又分為體液免疫和細胞免疫。

抗血清之所以能和有關抗原起免疫結合反應，是因為在抗血清中，含有相關的抗體蛋白質。在20世紀60年代初將具有抗體活性的動物蛋白定義為免疫球蛋白（immunoglobulin）。主要存在于血漿中，也見于其他體液、組織和一些分泌液中。一般Ig分子上L鏈的抗原性總是相同的(κ或λ)。但H鏈抗原性不相同（μ鏈、γ鏈、α鏈、δ鏈和ε鏈），據其將不同H鏈與L鏈組成完整Ig的分子可分為五類，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE），IgG，IgA和IgM還有亞類。Ig分子的基本結構是由四肽鏈組成的，即由二條相同的分子量較小的輕鏈（L鏈）和二條相同的分子量較大的重鏈（H鏈）組成的。

人體血清免疫球蛋白的主要成分是IgG，它占總的免疫球蛋白的70-75%，分子量約15萬，含糖2～3%。

人體血清免疫球蛋白IgG是初級免疫應答中最持久、最重要的抗體，它僅以單體形式存在。大多是抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgG，它在抗感染中起到主力軍作用，能夠促進單核巨噬細胞的吞噬作用（調理作用），中和細菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原結合使病毒失去感染宿主細胞的能力（中和病毒）。IgG在機體合成的年齡要晚于IgM，在出生后第3個月開始合成，3-5歲接近成年人水平。它是唯一能通過胎盤的Ig，在自然被動免疫中起重要作用。此外，IgG還具有調理吞噬和結合SPA等作用。

1993年，Hamers-Casterman等報道了在駱駝科動物（單峰駝，雙峰駝，美洲駝等）體內存在一種只含重鏈不含輕鏈的天然重鏈抗體（Heavy?chain?antibody，HCAb）。之后，在一些軟骨魚體內也發現了與駱駝重鏈抗體結構相似的新抗原受體(new?antigen?receptor，NAR)。

由于駱駝重鏈抗體是純天然的，不能直接作用于人，或者為人類所用。因此克隆駱駝體內重鏈抗體的可變區后，得到的僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體，稱之為重鏈可變區基因抗體(variable?domain?of?heavy?chain?of?heavy-chain?antibody，VHH)，其直徑為2.5nm，長4nm，因此又被稱為納米抗體。作為一種小型的基因工程抗體，納米抗體具備的高表達性、水溶性、穩定性、強組織穿透性及較弱的免疫原性等優點，使得該抗體在基礎研究及藥物開發等領域擁有廣闊的前景[10]。目前，在歐美地區，基于駱駝重鏈抗體的VHH單域抗體的研究已成為一熱點[11]，但在國內仍鮮見報道。

納米抗體作為一個嚴格的單體，其特殊的結構及性質，使其具備一些其他普通抗體不具有的獨特性質。如容易獲得和表達、高水溶性和穩定性、靶向性、人源化簡單等。

目前國內報道中，僅對一峰駱駝的血清分析不同抗原在駱駝的免疫過程中產生重鏈抗體的情況，不免存在偏頗。而則國外的研究重點在于重組VHH抗體的理化性質、應用以及抗原靶向性方面。目前對于制備駱駝抗體免疫過程的最佳條件卻未有報道。

鑒于納米抗體的強大優勢及應用。本發明以內蒙古蘇尼特雙峰駝為研究對象，本著抗原應用最普遍、易得的原則，針對一定量的駱駝群體進行分析，制備駱駝抗BSA多克隆抗體，探索雙峰駝特異性抗體制備過程中的機體反應變化，確定駱駝的最佳免疫次數。為今后分析雙峰駝重鏈抗體的抗病保護作用，制備納米抗體做鋪墊，同時為今后研發新型的基因工程抗體提供新的方向。

同時，由于國際市場上抗駱駝IgG酶標二抗還沒有商品化，為今后納米抗體的研究帶來不便，本發明通過制備兔抗駱駝IgG酶標二抗，建立ELISA方法診斷試劑盒，檢測免疫后的駱駝血清中抗體的效價。

（三）發明內容

1.本發明要求保護免疫駱駝的最佳免疫程序及方法；

本發明免疫方法為雙峰駝背部皮下多點注射，免疫周期為2周，注射抗原劑量為1mg/mL，免疫次數為3次；

2.本發明要求保護制備兔抗駱駝IgG酶標二抗所涉及的技術指標及結果；