[發明專利]一種人α-乳清白蛋白夾心ELISA檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201310395795.6
• 申請日: 2013-09-03
• 公開（公告）號: CN104422776A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 林祥梅;朱振營;王勤;劉建;付偉;孫敏;王燕
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/535
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體來說涉及人α-乳清白蛋白夾心ELISA檢測試劑盒及其應用。

背景技術

在轉基因生物新品種培育重大專項和國家其他經費的資助下，我國轉基因豬、牛和羊新品種研發獲得了蓬勃發展，多個轉基因動物品種展示了良好的產業化前景，其中發展最為迅速的是乳腺生物反應器的利用，目前轉人α-乳清白蛋白基因奶牛已經通過了農業部規定的中間試驗、環境釋放及生產性試驗。

由于轉基因生物及其產品存在風險，轉基因生物及產品的管理一直受到各國政府的高度重視。牛奶和奶制品是人們餐桌上最常見的一類食物，食品安全直接關系民生，在沒有足夠的數據證明其安全之前，質檢機構均有責任和義務去檢測和監測這些已上市或即將上市的轉基因產品。開發一種實用、靈敏、特異的人α-乳清白蛋白成分檢測試劑十分必要。

目前用于檢測α-乳清白蛋白的方法主要有高效液相色譜法、毛細管電泳法、放射性免疫法和酶聯免疫吸附法等，但是檢測人α-乳清白蛋白的報道卻并不多。雙抗體夾心ELISA又稱抗原捕捉ELISA，該方法已被大量用于動物疫病的臨床診斷，該方法最關鍵的條件是制備高純度的包被抗體，純度越高，則特異性越好，但尚無人α-乳清白蛋白轉基因成分雙抗體夾心ELISA檢測方法的報道。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明目的是提供一種人α-乳清白蛋白夾心ELISA檢測試劑盒。

本發明另一目的是提供人α-乳清白蛋白夾心ELISA檢測試劑盒檢測人α-乳清白蛋白的方法。

本發明再一目的是提供人α-乳清白蛋白夾心ELISA檢測試劑盒在檢測轉基因牛奶及奶制品中人α-乳清白蛋白含量中的應用。

為了實現本發明的目的，本發明首先提供了一種人α-乳清白蛋白的夾心ELISA檢測試劑盒，包括包被抗體和酶標抗體，其中所述包被抗體為人α-乳清白蛋白多克隆抗體，所述酶標抗體為人α-乳清白蛋白單克隆抗體。

其中，所述人α-乳清白蛋白單克隆抗體由保藏號為CGMCC?NO:7459的雜交瘤細胞株分泌獲得。

雜交瘤細胞ZZY?hLY7E1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101），保藏日期為2013年4月26日，保藏編號為CGMCC?No.7459。

用原核表達重組蛋白hLA免疫雌性BALB/c小鼠，取脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合，經ELISA法進行陽性克隆篩選、通過有限稀釋法進行亞克隆，獲得穩定分泌抗hLA的1株細胞7E1。取雜交瘤細胞注射至小鼠腹腔，收集腹水，親和柱純化得單克隆抗體。

細胞7E1能與免疫原hLA反應，不與篩選原牛α-乳清白蛋白（bLA）反應。Western?Blot檢測顯示抗體7E1只與轉基因牛奶及奶粉反應，不與非轉基因牛奶及奶粉反應。

其中，所述酶標抗體的標記酶為辣根過氧化物酶。

其中，所述人α-乳清白蛋白多克隆抗體是以人α-乳清白蛋白作為免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加強免疫后7天收集血清，分離純化得到。

純化抗體通過考馬斯亮藍驗證，多克隆抗體能滿足要求，濃度約為1mg/mL。采用間接ELISA法對抗體IgG進行鑒定，抗體效價達到1∶200,000。

其中，檢測樣本中免疫抗原檢測限為250ng/mL。

進一步地，所述人α-乳清白蛋白的夾心ELISA檢測試劑盒還包括以下試劑中的一種或幾種：

1）洗滌液；

2）底物顯色液；

3）反應終止液；

4）人α-乳清白蛋白標準品。

更進一步地，所述洗滌液為PBST，所述底物顯色液為TMB，所述反應終止液為2mol/L?H₂SO₄。

本發明還提供了前述試劑盒檢測人α-乳清白蛋白的方法，包括如下步驟：

1）向包被人α-乳清白蛋白多克隆抗體的酶聯板中加入人α-乳清白蛋白抗原標準品和待檢測樣品，洗滌液洗板；

2）加入酶標人α-乳清白蛋白單克隆抗體，洗滌液洗板；

3）加入底物顯色液顯色，加入反應終止液終止反應，測定OD450值；

4）以人α-乳清白蛋白抗原標準品的劑量-效應曲線為標準曲線，計算樣品人α-乳清白蛋白的含量。

本發明還提供了前述試劑盒在檢測轉基因牛奶及奶制品中人α-乳清白蛋白含量中的應用。

具體包括以下步驟：

I?IgG標準曲線的建立：