[發明專利]一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201310395427.1
• 申請日: 2013-09-02
• 公開（公告）號: CN103463631A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 王立新;曹萌
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K39/39;C12N5/09;C12N5/0781;A61P35/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗，其特征是這種B細胞疫苗含有Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-Dribbles。

2.一種如權利要求1所述的基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗的制備方法，其特征是該方法按如下步驟制備：

1)Hepa1-6肝癌細胞的培養：

復蘇凍存的Hepa1-6肝癌細胞，用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基，在37℃、5%(v/v)CO₂的恒溫培養箱中培養，每1～2天換液一次，常規0.25%(w/v)胰蛋白酶消化傳代；

2)Hepa1-6肝癌細胞的處理：

待步驟1)培養后的細胞待生長良好后，加入雷帕霉素、萬珂和氯化銨，雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干預Hepa1-6肝癌細胞16小時，誘導Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles；

3)提取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles：

將步驟2)誘導后的細胞經離心得到沉淀，即為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles；

4)制備B細胞疫苗：

4a)取野生C57BL/6小鼠頸椎脫臼法處死，用75%酒精浸泡5min，放于解剖板上充分暴露腹腔，分離脾臟放入PBS磷酸緩沖鹽中，用無菌磨載玻片將脾臟磨碎，經200目篩網濾過并收集脾臟單核細胞；

4b)將步驟4a)收集的脾臟單核細胞以紅細胞裂解液裂解5min，PBS磷酸緩沖鹽洗滌，1000rpm離心10min，收獲脾臟單核細胞并制備成脾臟單核細胞懸液；

4c)將CD43Dynabeads放入15ml離心管，用分離緩沖液洗滌；

4d)取500ul4c)中洗滌過的dynabeads與4b)制備的單細胞懸液混勻中，室溫孵育25min；

4e)加分離緩沖液，并吹打混勻dynabeads-脾細胞，放入磁場2min，上清液轉移至另一離心管；

4f)重復步驟4e)，收取上清，1000rpm離心10min，沉淀即為收獲的B細胞，之后RPMI-1640培養液重懸B細胞至2×10⁶個/ml；

4g)將制備好的B細胞與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles混合孵育6小時，得基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗。

3.根據權利要求2所述的一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗的制備方法，其特征在于，步驟3)中，提取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles具體包含如下步驟：

3a)將Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles及培養液倒入離心管中，低速離心1200rpm，10min；

3b)將步驟3a)離心后的上清倒入超速離心管，高速離心12000rpm，30min，4℃；

3c)將步驟3a)離心后沉淀的細胞用磷酸鹽緩沖液重懸，低速離心1200rpm，10min，將低速離心后的上清再次倒入另一超速離心管中，高速離心12000rpm，30min，4℃；

3d)將步驟3b)和3c)兩次高速離心后得到的沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，合并，12000rpm高速離心30min，4℃；

3e)棄步驟3d)得到的上清，沉淀即為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles，將沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸后分裝，凍存于-20℃，備用。