[發(fā)明專利]以玉米胚珠為受體的轉基因方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310395028.5
• 申請日: 2013-09-04
• 公開（公告）號: CN103497970A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設計）人: 陳亮;賀紅霞;叢媛媛;郝東云
• 申請（專利權）人: 吉林省農業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H4/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

1.以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特征在于具體步驟如下：

1）農桿菌侵染液的制備：挑取含目標基因的農桿菌單菌落接種于YEP液體培養(yǎng)基中，在28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，4000rpm，4℃離心10min后收集菌體，重懸于pH?5.2的侵染培養(yǎng)基中，調節(jié)菌液濃度至OD₆₀₀?=?0.3-0.4后存于4℃?zhèn)溆茫?/p>

2）玉米胚珠受體的分離：玉米雌穗抽絲前套袋，在花絲已抽出5-10cm時自花授粉，于花絲授粉后24h取下雌穗，首先用70%酒精擦拭苞葉，并小心剝開內部苞葉，然后把雌穗在1.5%次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水至少洗3次；在超凈工作臺上用解剖刀將雌穗在麥芽糖溶液（90?gl）中取下中部胚珠，用直徑為0.4mm的注射針在胚珠壁靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁；

3）農桿菌侵染轉化與培養(yǎng)：將10μl農桿菌侵染液置于胚珠表面，侵染5min后，吸除表面多余菌液；將農桿菌侵染轉化后的胚珠轉入pH?5.8的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿約接種25個胚珠，23℃暗培養(yǎng)3天；共培養(yǎng)階段結束后，將胚珠轉移到pH?5.8的誘導培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)1-2周，光/暗周期為16/8h，直至小苗出現(xiàn)主莖；將小苗轉移到pH?5.8的生根培養(yǎng)基，經25℃光照培養(yǎng)2-4周，光/暗周期為16/8h，當小苗長至10cm時，移栽至帶土的花盆中；

4）轉基因植株的分子鑒定：采用PCR或Southern雜交檢測轉基因植株，將陽性植株在溫室中培養(yǎng)至成熟。

2.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特征在于所述的侵染培養(yǎng)基的組分如下：1/2?N6大量，1/2?B5微量，MS維生素，0.001?g/l?水解酪蛋白，0.7?g/l?脯氨酸，0.15?g/l?肌醇，68.4?g/l?蔗糖，36?g/l?葡萄糖，0.5?g/l?2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001?g/l?玉米素，0.01962?g/l?乙酰丁香酮，0.1%植物表面活性劑Silwet-L77。

3.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特征在于所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下：?1/2?N6大量，1/2?B5微量，MS維生素，0.001?g/l?水解酪蛋白，0.7?g/l?脯氨酸，0.15?g/l?肌醇，150?g/l?蔗糖，0.5?g/l?2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001?g/l?玉米素，0.03924?g/l?乙酰丁香酮，3g/l?植物凝膠。

4.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特征在于所述的誘導培養(yǎng)基的組分如下：?N6大量，B5微量，MS維生素，1?g/l?水解酪蛋白，0.7?g/l?脯氨酸，0.15?g/l?肌醇，150?g/l?蔗糖，0.5?g/l?2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.001?g/l?玉米素，0.25?g/l?羧芐青霉素，0.0015?g/l?雙丙氨膦，3?g/l?植物凝膠。

5.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特征在于所述的再生培養(yǎng)基的組分如下：N6大量，B5微量，MS維生素，0.25?g/l?水解酪蛋白，?0.7?g/l?脯氨酸，0.15?g/l?肌醇，60?g/l?蔗糖，0.5?g/l?2-N-嗎啉-?乙基磺酸，0.001?g/l?玉米素，0.003?g/l?雙丙氨膦，3?g/l?植物凝膠。

6.根據權利要求1所述的以玉米胚珠為受體的轉基因方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)基的原料組成如下：N6大量，B5微量，MS維生素，0.25?g/l?水解酪蛋白，30?g/l?蔗糖，0.5?g/l?2-N-嗎啉-乙基磺酸，0.003?g/l?雙丙氨膦，3g/l?植物凝膠。