[發明專利]重組PRRS病毒HV?nsp9及其應用

有效

• 申請號: 201310394833.6
• 申請日: 2013-09-03
• 公開（公告）號: CN104419686B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發明（設計）人: 封文海;高麗;楊丙田;王良海;郭雪坤;余志彬;劉翼浩;陳鑫鑫;唐軍;鄭世軍
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/12;A61P31/14;C12N15/54;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種重組PRRS病毒HV-nsp9及其應用。

背景技術

在生物體中，每種氨基酸至少對應一個密碼子,最多的有六種對應的密碼子,編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。研究表明,生物體內普遍存在同義密碼子非均衡使用的現象,例如:某一物種或某一基因通常傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子,這些密碼子被稱為最優密碼子(optimal?codon),此現象被稱為密碼子偏好性(codon?bias)。同樣的，密碼子對的使用也有偏好性，但是密碼子對的偏好性并不依賴于密碼子的偏好性。例如，精氨酸(arginine,Arg)可以被六種密碼子編碼，谷氨酸(glutamic?acid,Glu)可以被兩種密碼子編碼，所以氨基酸對Arg-Glu可以被十二種同義密碼子對編碼，如果根據密碼子的偏好性計算每個同義密碼子對在人類基因組中的出現次數，那么理論上密碼子對CGC-GAA的出現次數為2,397次，但實際只出現了268次，所以CGC-GAA在人類基因組中是非偏好性密碼子對；而密碼子對AGA-GAA編碼Arg-Glu的理論次數是2,644次，但其實際出現次數則是4,195次，因此AGA-GAA是人類基因組中的偏好性密碼子對。

盡管到目前為止人們并不清楚密碼子對偏好性的形成原因，但是密碼子對的使用卻是可以影響翻譯效率的。2008年，Coleman等人把脊髓灰質炎病毒(poliovirus)的核衣殼(capsid)基因進行了突變，在不改變氨基酸序列及RNA二級結構的前提下，在基因內進行同義密碼子置換，使得偏好性的密碼子對被置換為非偏好性的密碼子對，化學合成突變后的片段，然后利用反向遺傳學手段將合成的片段連入病毒全長cDNA克隆，這種致弱病毒的方法稱為合成病毒致弱工程(synthetic?attenuated?virus?engineering,SAVE)。置換后病毒capsid基因的翻譯速率顯著下降，并且含有突變序列的重組病毒在體外細胞上的復制能力和在小鼠中的致病力都明顯降低，在攻毒試驗中，重組病毒能夠有效的保護野生型毒株對于免疫小鼠的再次感染。這種病毒弱化的方法具有廣泛的應用性，2010和2013年，分別有人用同樣的方法改造了流感病毒，獲得了致弱效果明顯的流感病毒弱毒株。最重要的是，在這種致弱病毒的工程中，病毒的弱化是由成百上千個點突變引起的，因此其發生返強的可能性極低。

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine?reproductive?and?respiratory?syn—drome，簡稱PRRS)，俗稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductive?and?respiratory?syndrome?viruse，PRRSV)引起的一種高發病率、高死亡率、低治愈率的豬病。目前，世界上廣泛使用商品化的PRRS疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗。滅活的PRRSV疫苗沒有效果或者是只能對同源毒株的感染提供有限的保護；弱毒疫苗持續散播病毒，尤其有回復突變以致毒力返強的可能性，弱毒疫苗的返強性一直是人們擔心的一個安全問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種可以作為弱毒疫苗毒株的重組PRRS病毒。

本發明要求保護的重組PRRS病毒HV-nsp9，其基因組對應的cDNA序列為將序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列替換為序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列所獲得的序列。

序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列為序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列的DNA片段，也是本發明需要保護的；

同時，含有該片段的重組質粒、重組菌或重組細胞，也是本發明需要保護的。具體地說，所述重組質粒為將質粒pcDNA3.1-HV中對應于序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列替換為序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列得到的質粒。質粒pcDNA3.1-HV是將序列表中的序列1所示的HV毒株的基因組全長序列克隆到了真核表達載體pcDNA3.1中得到的。

上述重組質粒在制備重組PRRS病毒HV-nsp9或PRRS疫苗中的應用，以及重組PRRS病毒HV-nsp9在制備PRRS疫苗中的應用，也是本發明需要保護的內容。