[發明專利]一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2的單克隆抗體及其應用

有效

• 申請號: 201310393799.0
• 申請日: 2013-09-02
• 公開（公告）號: CN104278013B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 張紅軍;韓原平
• 申請（專利權）人: 武漢諧康科技有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;A61K39/395;A61P1/16;C12R1/91
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的單克隆抗體，還涉及一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的單克隆抗體在治療小鼠肝纖維化中的應用。

背景技術

肝硬化是一種常見的慢性肝病，是肝嚴重纖維化的結果，將導致肝功能的逐步喪失，其病因包括肝病毒感染，酒精濫用以及其他因素。肝纖維化也為腫瘤的發生提供了環境，它不僅能激活腫瘤細胞，也能促進腫瘤的轉移。2006年全國肝炎流性病學調查結果顯示，我國人群乙型肝炎表面抗原攜帶率為7.18%，估算約有4.57億人曾感染過乙肝病毒，其中9300萬人為HBsAg攜帶者,其肝硬化和肝癌的發生率很高。肝癌目前在中國癌癥死亡率上排名第二。我國每年因慢性肝病及肝硬化造成的經濟損失估計為5000億元人民幣。在美國大約有4百萬人患有慢性肝炎，并且肝癌的死亡率排名第八。每年因慢性肝病及肝硬化造成的經濟損失估計為16億美元。然而國際上有效治療肝纖維化的方法是缺乏的。針對這一嚴峻現狀，迫切需要研究和開發一種有效的治療肝纖維化的創新方法。

肝纖維化起源于肝細胞外基質（ECM）過多的的交叉連接，這種連接就造成了肝組織剛度的增加并且不可逆轉。在多個ECM交聯酶中，組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）已被發現是一個很重要的因子，出現在包括肝硬化在內的各種組織纖維化的發病機制中。為了對抗tGM2的活性，具有烷基化功能的小分子抑制劑已經被研發。然而，它們的烷基化功效和組織接觸性較差，妨礙了這些小分子抑制劑的治療應用。我們的研究數據表明，肝纖維化是出現在免疫耐受的狀態下。在此狀態下基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達被抑制，免疫監視系統受損，組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的表達及酶活性增加，最終導致纖維組織過度增生和腫瘤的生長。

已有的發現給我們一個啟示：如果能制備出一種單克隆抗體，既能抑制tGM2的酶活性，又能激活抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC），恢復基質金屬蛋白酶在纖維化組織表面的表達和活性，將會大大促進纖維化的溶解和消退。基于這個理念，我們已成功地建立了一株抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的單克隆抗體。該抗體不僅能體外抑制人tGM2的酶活性，而且在小鼠模型中能恢復基質金屬酶（MMPs）的表達，降低肝纖維化的程度，已顯示出該抗體的治療功效。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的單克隆抗體，該單克隆抗體由大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）雜交瘤細胞XK-1分泌，所針對的靶標位點位于人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的酶活性位點內，在小鼠和人等多種物種間高度保守。該抗體顯示出高度的特異性，并能有效地抑制組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的酶活性。

本發明還有一個目的是在于提供了一種大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）雜交瘤細胞XK-1，該雜交瘤細胞可分泌抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的單克隆抗體，該細胞已于2013年1月14日送至中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名：大鼠抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）雜交瘤細胞XK-1,保藏編號：CCTCC?NO:C201312，地址：中國武漢武漢大學。

本發明最后一個目的是在于提供了一種用抗人轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的單克隆抗體在制備治療小鼠肝纖維化藥物中的應用。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施：

一、靶標抗原決定簇的設計和多肽的合成：

利用文獻檢索和蛋白質氨基酸序列分析，申請人在轉谷氨酰胺酶2（tGM2）的酶活性區域發現了一段高度保守的氨基酸序列，其序列為SEQ?ID?NO:1所示。該序列在小鼠、大鼠和人類之間高度保守。申請人按此序列進行了多肽的合成(由美國NeoBiolab公司合成)。多肽與載體蛋白匙孔血藍蛋白（Keyhole?Limpet?Hemocyanin，簡稱KLH）進行偶聯(由美國NeoBiolab公司合成)，作為免疫原去免疫大鼠。

二、抗人組織轉谷氨酰胺酶2（tGM2）單克隆抗體的制備：

A、SD大鼠的免疫