[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標記基因敲除的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310392856.3
• 申請日: 2013-09-02
• 公開（公告）號: CN104419719B
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李寧;孫照霖;康倩倩;吳森;李秋艷;溫嘯;趙蕊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61D19/00;A01K67/027;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王朋飛

1.一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標記基因敲除的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1)構(gòu)建自我剪切元件PCN；所述自我剪切元件PCN包括豬精子特異啟動子、Cre重組酶基因和neo篩選標記基因；

2)構(gòu)建帶有自我剪切元件的打靶載體；將步驟1)構(gòu)建的自我剪切元件PCN替換于普通的打靶載體的正篩選基因當中，得到帶有自我剪切元件的打靶載體；

3)篩選陽性克隆細胞；

4)體細胞克隆獲得F0代陽性公豬；

5)配種繁殖獲得自動敲除標記基因的F1代個體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)將步驟2)得到的帶有自我剪切元件的打靶載體，轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞，進行正負篩選獲得打靶成功的陽性克隆細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述打靶載體為MSTN-PCN marker free打靶載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)將步驟3)篩選得到的陽性克隆細胞作為核移植供體細胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術(shù)進行體細胞克隆獲得F0代的陽性公豬。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟5)將步驟4)獲得F0代的陽性公豬進行配種繁殖，獲得自動敲除標記基因的F1代個體。

6.權(quán)利要求1-5任一項所述的方法在生產(chǎn)基因敲除克隆豬中的應(yīng)用。