[發(fā)明專利]一種篩選細(xì)菌新菌種的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310392561.6
• 申請(qǐng)日: 2013-09-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103468802A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張文學(xué);黃丹;劉超蘭;吳正云;李文芳;張勁;羅青春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N1/20
• 代理公司: 成都科海專利事務(wù)有限責(zé)任公司 51202
• 代理人: 劉雙蘭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種將傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)與現(xiàn)代分子生物技術(shù)結(jié)合來(lái)篩選細(xì)菌新菌種的方法。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的微生物篩選方法主要是通過(guò)觀察微生物的個(gè)體形態(tài)、菌落形態(tài)以及一些生理生化特征對(duì)篩選所得微生物進(jìn)行初步分門(mén)歸屬，該方法對(duì)于篩選一些常見(jiàn)微生物較為實(shí)用，但往往只能將微生物的分類學(xué)地位確定到屬。對(duì)于分離純化尚未被培養(yǎng)的新菌種而言，由于環(huán)境中存在的微生物類別復(fù)雜，一些微生物的菌落形態(tài)特征以及個(gè)體形態(tài)差別甚微，特別是同一個(gè)屬下不同種的微生物，新菌種的個(gè)體形態(tài)特征、菌落形態(tài)可能與已知菌種十分接近，并且篩選者并非對(duì)所有微生物的形態(tài)都了然，在篩選過(guò)程中極易出現(xiàn)漏篩和錯(cuò)篩新菌種的情況，因而通過(guò)觀察的方法來(lái)指導(dǎo)篩選新菌種的準(zhǔn)確性不高、難度大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種篩選細(xì)菌新菌種的方法，該方法準(zhǔn)確、快速，可避免傳統(tǒng)篩選方法的盲目性及隨機(jī)性。

一種篩選細(xì)菌新菌種的方法，步驟如下：

（1）富集培養(yǎng)樣品中的細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到第一代純化產(chǎn)物；

（2）提取、純化步驟（1）中每一個(gè)第一代純化產(chǎn)物的總DNA，然后PCR擴(kuò)增其16S?rDNA，將所得總16S?rDNA插入到原核載體中構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，然后將原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，篩選出陽(yáng)性克隆子，提取陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行酶切分析，將酶切圖譜相同的歸為同一個(gè)分類操作單位，從每個(gè)分類操作單位中取1～2個(gè)克隆子的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；

（3）分別將步驟（2）中測(cè)得的16S?rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S?rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S?rDNA序列同源性低于97%的序列，即目標(biāo)菌種16SrDNA序列；

（4）取含有目標(biāo)菌種16S?rDNA序列的克隆子，提取其質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒中的16S?rDNA可變區(qū)，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）將含目標(biāo)菌種的第一代純化產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化，得第二代純化產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增每一個(gè)第二代純化產(chǎn)物的16S?rDNA可變區(qū)；

（6）分別對(duì)步驟（5）獲得的16S?rDNA可變區(qū)樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，以步驟（4）所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)記物，篩選出含有目標(biāo)菌種且電泳條帶最少的第二代純化產(chǎn)物；

（7）以步驟（6）中篩選出的純化產(chǎn)物為基礎(chǔ)，重復(fù)步驟（5）、（6）的操作對(duì)所述純化產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，直到16S?rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶中只含有與標(biāo)記物的電泳條帶位置一致的電泳條帶，即篩選得到純化的新菌種。

上述方法中，細(xì)菌的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的組成參照樣品細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌種的相似菌中的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的組成來(lái)確定；所述優(yōu)勢(shì)菌種的相似菌種可由下述方法確定：通過(guò)細(xì)菌樣品的16S?rDNA的分子克隆文庫(kù)獲知細(xì)菌樣品中占優(yōu)勢(shì)的16S?rDNA序列，將優(yōu)勢(shì)16S?rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S?rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，篩選獲得與優(yōu)勢(shì)16S?rDNA序列同源性最高的菌種，即為相似菌種。

上述方法中，細(xì)菌的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的組成也可根據(jù)目標(biāo)菌種的功能特點(diǎn)來(lái)確定。

上述方法中，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化時(shí)，采用亨蓋特嚴(yán)格厭氧技術(shù)對(duì)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離純化。

上述方法中，步驟（2）所述原核載體為pUCm-T，所述感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

上述方法中，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化時(shí)，應(yīng)挑取所有菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。

上述方法中，所述挑取所有菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，最好從每個(gè)單菌落中挑取2～3個(gè)樣品進(jìn)行培養(yǎng)。

上述方法中，所述進(jìn)行變性梯度凝膠電泳時(shí)，若16S?rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶中含有與所述標(biāo)記物電泳條帶位置一致的條帶，則該16S?rDNA可變區(qū)樣品對(duì)應(yīng)的菌液中含有目標(biāo)菌種，16S?rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶越少，表明該16S?rDNA可變區(qū)樣品對(duì)應(yīng)的菌液中目標(biāo)菌種的純化程度越高，下一步純化時(shí)便以該菌液為基礎(chǔ)；若16S?rDNA可變區(qū)樣品的電泳條帶中只含有與標(biāo)記物的電泳條帶位置一致的電泳條帶時(shí)，表明該16S?rDNA可變區(qū)樣品對(duì)應(yīng)的菌液中只含有目標(biāo)菌種，純化完成。

上述方法中，在步驟（7）獲得純化的新菌種后，對(duì)所得純化的新菌種進(jìn)行16S?rDNA測(cè)序，并將測(cè)得的16S?rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S?rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，以確保純化的菌種為新菌種。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益的技術(shù)效果：