[發(fā)明專利]一種改造的土曲霉工程菌及其和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310391924.4
• 申請日: 2013-09-02
• 公開（公告）號: CN104419650A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李建軍;黃雪年;呂雪峰;李悅明;張希銘;李霞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所;青島科海生物有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/63;C12P7/44;C12R1/66
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種改造的土曲霉工程菌及其和應(yīng)用。

背景技術(shù)

衣康酸是一種重要的化工產(chǎn)品，被美國能源部認為是十二個重要高附加值化學(xué)品之一，主要用于腈綸化纖、樹脂、橡膠、涂料、造紙、醫(yī)藥、農(nóng)藥、輕工、食品、絲綢等領(lǐng)域。自然界中有多種絲狀真菌能將單糖轉(zhuǎn)換成衣康酸，其中土曲霉作為衣康酸生產(chǎn)菌株被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前，土曲霉發(fā)酵產(chǎn)衣康酸所用的碳源主要是葡萄糖，而工業(yè)生產(chǎn)中的葡萄糖主要是淀粉經(jīng)過兩個步驟水解獲得，首先淀粉經(jīng)過α-淀粉酶液化后得到淀粉液化液，然后再經(jīng)糖化酶的糖化作用最終獲得糖化液，即葡萄糖液（高善禮.新型糖化酶在淀粉制葡萄糖中的應(yīng)用.安徽化工，2012，38（4）：24-26.）。黑曲霉水解淀粉的酶系較發(fā)達，能直接通過利用淀粉作為碳源來生長，其高效分泌糖化酶的能力尤為突出，已被工業(yè)化應(yīng)用于生產(chǎn)糖化酶。因此在有些黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸的工藝中直接采用淀粉液化液作為原料進行發(fā)酵，省去了添加糖化酶進行糖化的過程。為了簡化土曲霉發(fā)酵產(chǎn)衣康酸工藝從而降低生產(chǎn)成本，對菌株進行改良、開發(fā)具有更多優(yōu)良特性的菌株具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種改造的土曲霉工程菌及其和應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種改造的土曲霉工程菌，所述菌株為通過基因工程改造在土曲霉中插入糖化酶表達框得到的重組土曲霉。

所述糖化酶表達框由絲狀真菌啟動子、編碼糖化酶的核苷酸序列和終止子組成；其中，啟動子為土曲霉自身的檸檬酸合成酶基因的啟動子；編碼糖化酶的核苷酸序列為黑曲霉的糖化酶基因；終止子為構(gòu)巢曲霉的TtrpC終止子。

改造的土曲霉工程菌的構(gòu)建方法，通過基因工程改造構(gòu)建糖化酶表達框，將其插入土曲霉中得到含有糖化酶表達框的重組土曲霉。

改造的土曲霉工程菌的應(yīng)用，利用改造的土曲霉工程菌發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸。

采用改造的土曲霉工程菌作為發(fā)酵菌株于以淀粉液化液或淀粉糖化液作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸。

本發(fā)明提供的基因工程改造的土曲霉工程菌株，包含有一個糖化酶表達框（expression?cassette），該表達框由一個絲狀真菌啟動子、編碼糖化酶的核苷酸序列和終止子組成。所采用的絲狀真菌啟動子為來源于土曲霉自身的檸檬酸合成酶基因的啟動子，由613個堿基組成。所用編碼糖化酶的核苷酸序列是來自于黑曲霉的糖化酶基因，大小為1923bp如序列所示。所采用的終止子為來源于構(gòu)巢曲霉的TtrpC終止子。

制備這種基因修飾的土曲霉菌株包括以下步驟：

1）構(gòu)建攜帶有糖化酶基因的表達盒Pcs3-gla1-TtrpC的質(zhì)粒pXH43-gla1；

2）利用質(zhì)粒pXH43-gla1轉(zhuǎn)化土曲霉CICC40205，獲得含有糖化酶基因表達盒Pcs3-gla1-TtrpC的土曲霉工程菌株。

利用上述土曲霉工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸的方法，在該方法中發(fā)酵培養(yǎng)基所使用的碳源可以是未經(jīng)糖化的淀粉液化液，也可以是淀粉液化液部分糖化后的產(chǎn)物（縮短糖化時間）。采用該土曲霉作為發(fā)酵菌株生產(chǎn)衣康酸，能夠省去利用糖化酶水解的糖化工藝或者縮短糖化時間，并且該土曲霉工程菌株自身分泌表達的黑曲霉糖化酶能水解糖液中殘留的麥芽糖等寡糖，最終能提高殘?zhí)堑睦寐剩档鸵驴邓岬纳a(chǎn)成本。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：利用本發(fā)明構(gòu)建土曲霉發(fā)酵產(chǎn)衣康酸，使在制糖工藝中省略糖化工藝，或者縮短糖化時間，經(jīng)過該方法改造的土曲霉工程菌株在發(fā)酵過程中能高效利用淀粉液化液作為原料生產(chǎn)衣康酸。

采用本發(fā)明提供的土曲霉工程菌株以淀粉液化液為原料直接發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸，在搖瓶發(fā)酵階段，終點衣康酸產(chǎn)量為55.6g/L，而在相同條件下，未經(jīng)本發(fā)明改造的出發(fā)菌株土曲霉CICC40205的終點衣康酸產(chǎn)量為17.1g/L。

本發(fā)明針對土曲霉菌株實施基因工程改造，從分子水平提高土曲霉表達分泌糖化酶的能力，從而提高土曲霉直接利用淀粉液化液發(fā)酵產(chǎn)衣康酸的能力，簡化土曲霉發(fā)酵產(chǎn)衣康酸的生產(chǎn)工藝。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的載體pJL-8質(zhì)粒圖譜。其中hph-casette為潮霉素抗性元件；sgfp為綠色熒光蛋白基因；TtrpC為構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子；Pcs3為土曲霉檸檬酸合成酶基因啟動子。