[發(fā)明專利]一種減少L-絲氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062代謝副產(chǎn)物的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310391569.0
• 申請(qǐng)日: 2013-09-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103820485A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許正宏;史勁松;羅玉常;竇文芳;張曉梅;張旦旦;陸震鳴;許鴻瑜;李恒;李會(huì);耿燕;趙芹芹;方佳茂;陳偉濱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);廣東環(huán)西生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/77
• 分類號(hào): C12N15/77;C12N1/21;C12R1/15
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及一種減少L-絲氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062代謝副產(chǎn)物的方法及其應(yīng)用，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

[0002]?L-絲氨酸，化學(xué)名為α-氨基-β-羥基丙酸，分子式為C₃H₇NO₃，分子量105.10。L-絲氨酸屬于非必需氨基酸，具有許多重要的生理功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域具有較為廣泛的應(yīng)用。

L-絲氨酸是一種瓶頸氨基酸，近年來(lái)，雖然有很多關(guān)于L-絲氨酸生產(chǎn)方法的研究報(bào)告，但迄今為止尚缺乏較為經(jīng)濟(jì)、有效的工業(yè)化生產(chǎn)方法，我國(guó)至今沒(méi)有實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，產(chǎn)品需求主要依賴進(jìn)口。2010年我國(guó)絲氨酸市場(chǎng)需求量為350噸，其中國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的20％基本采用水解天然蛋白質(zhì)的方法，該方法操作費(fèi)時(shí)，收率和產(chǎn)量低，成本高，不適合大規(guī)模的生產(chǎn)，同時(shí)存在較為嚴(yán)重的污染問(wèn)題。因此，研究和開(kāi)發(fā)發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的新菌種、新工藝對(duì)于打破日本等國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)在L-精氨酸等品種上的壟斷具有十分重要的意義，也將進(jìn)一步提升我國(guó)發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的整體技術(shù)水平，完善我國(guó)氨基酸工業(yè)，調(diào)整藥用氨基酸的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，滿足國(guó)內(nèi)藥用氨基酸市場(chǎng)需求。

目前，國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)L-絲氨酸的方法主要有化學(xué)合成法、蠶絲水解法、酶法、前體發(fā)酵法等生物法，但是利用糖質(zhì)原料通過(guò)直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的報(bào)道較少。其中以甘氨酸為前體經(jīng)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化生產(chǎn)L-絲氨酸生產(chǎn)技術(shù)己經(jīng)工業(yè)化，最近又開(kāi)發(fā)了采用具有高活絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)的甲醇同化菌由甘氨酸生產(chǎn)L-絲氨酸的方法，日本主要以甘氨酸為前體發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸，但前體物價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高。國(guó)內(nèi)主要以蠶絲水解法生產(chǎn)L-絲氨酸，即將廢蠶絲、蠶蛹、絲膠水解，以提取L-絲氨酸；此法操作復(fù)雜，需處理大量的洗脫液，所得的氨基酸常為混合氨基酸，還需進(jìn)一步分離、精制，不適合大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，由于生產(chǎn)技術(shù)難度高，生產(chǎn)成本大，價(jià)格居高不下，嚴(yán)重限制了L-絲氨酸的應(yīng)用。

為了能夠獲得L-絲氨酸的高效生產(chǎn)菌株和簡(jiǎn)化下游產(chǎn)物的分離純化工藝，在構(gòu)建高產(chǎn)菌株的時(shí)候需要除了需要提高菌株目標(biāo)產(chǎn)物生物合成途徑的效率，還需考慮盡可能地減少代謝副產(chǎn)物的積累。谷氨酸棒桿菌是氨基酸生產(chǎn)的重要菌株，現(xiàn)已用于L-谷氨酸、L-賴氨酸和L-蘇氨酸的氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)。江南大學(xué)藥學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選到一株能夠利用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌SYPS-062，通過(guò)隨機(jī)誘變篩選和代謝工程改造獲得的重組菌株能夠利用蔗糖發(fā)酵大量積累L-絲氨酸，但是發(fā)酵液中還存在有L-丙氨酸和L-纈氨酸兩種代謝副產(chǎn)物。

谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸三種氨基酸是以丙酮酸為中心代謝物形成代謝物三角，見(jiàn)圖1。L-絲氨酸通過(guò)L-絲氨酸脫氨催化其脫水脫氨生成丙酮酸，另外兩種副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸和L-纈氨酸均是以丙酮酸為前體物質(zhì)生物合成而來(lái)。L-絲氨酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化，一個(gè)方面是使得目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量降低，產(chǎn)物丙酮酸積累會(huì)影響菌體生理特性的同時(shí)增加發(fā)酵液中L-丙氨酸和L-纈氨酸在的含量，兩種氨基酸的積累不僅造成碳骨架和氮源的大量流失浪費(fèi)，而且會(huì)增加下游產(chǎn)物的分離提取工藝的復(fù)雜性和影響中產(chǎn)物的純度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明根據(jù)谷氨酸棒桿菌SYPS-062△S利用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的同時(shí)，發(fā)酵液中積累L-丙氨酸和L-纈氨酸兩種代謝副產(chǎn)物。本發(fā)明的目的在于，采用基因工程手段將催化相關(guān)代謝反應(yīng)的酶編碼基因在基因組水平實(shí)現(xiàn)敲除，減少通過(guò)L-絲氨酸脫氨酶（L-serine?deaminase）催化L-絲氨酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化，以及丙酮酸生物合成L-丙氨酸和Ｌ-纈氨酸的能力，提高主產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸積累的同時(shí)降低副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸和L-纈氨酸的合成能力。

選擇將L-絲氨酸脫氨酶（L-serine?deaminase）的編碼基因sdaA，以及L-丙氨酸和L-纈氨酸生物合成途徑中的轉(zhuǎn)氨酶編碼基因alaT和ilvE在谷氨酸棒桿菌SYPS-062△S基因組順序敲除，最終構(gòu)建一株sdaA,?alaT和ilvE共敲除的重組菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062△S-Ⅲ。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

分別按照如下實(shí)驗(yàn)方案分別將sdaA,?alaT和ilvE三個(gè)基因在基因組敲除，最終構(gòu)建獲得三重基因缺失的重組菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062△S-Ⅲ，具體構(gòu)建過(guò)程如下：