[發明專利]一種高溫重組木聚糖酶及其編碼基因和應用

無效

• 申請號: 201310391421.7
• 申請日: 2013-09-02
• 公開（公告）號: CN103436510A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 王飛;黃穎娟;時號
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/10;C12P19/14
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域。具體涉及對一種高溫重組木聚糖酶基因克隆和表達、耐熱及熱穩定性好的高溫重組木聚糖酶的制備及其在半纖維素降解中的應用。

背景技術

木聚糖廣泛存在于自然界，是植物細胞壁的主要組成成分之一，其含量僅次于纖維素，通常占高等植物細胞干重的7%-30%，在被子植物中甚至高30%-35%。目前，對于半纖維素酶的生物化學和分子生物學研究主要集中在木聚糖降解酶。木聚糖酶作用于木聚糖主鏈內的β-1,4糖苷鍵產生不同長度的木寡糖短鏈，能將木聚糖降解為低聚木糖和少量木糖。木聚糖酶在飼料、食品、造紙和醫藥行業等都有極大地應用價值及應用前景。已報道的能產木聚糖酶的微生物有細菌、鏈霉菌、曲霉、青霉和木霉等，人們研究和應用最多的是細菌、曲霉和木霉產木聚糖酶。而我國當前的研究工作起步相對較晚，成熟的木聚糖酶產品較少，尤其缺乏能夠與規模化生產相適應的高產菌株，因此有必要進一步開展木聚糖酶基因工程菌的構建及其分子改造工作。了解酶的理化性質將有助于未來更好的利用這生物催化酶。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種高溫木聚糖酶，以使其滿足使用要求。本發明的另一目的是提供一種編碼上述高溫木聚糖酶的基因。本發明還有一目的是提供上述一種高溫木聚糖酶的應用。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種高溫木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

一種編碼高溫木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示。

一種表達高溫木聚糖酶的重組體系，在所述的重組體系上克隆有SEQ?ID?NO.2所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質粒和重組菌。

一種擴增編碼高溫木聚糖酶的基因的方法，所使用的引物對為：

引物1：5’-?GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGA-3’?；

引物2：5’-?CCGCTCGAGCTCCGGCTTAACCAGAGCCCAATATGCCA-3?。

所述的高溫木聚糖酶在酶解木聚糖中的應用。酶解反應溫度為75-100℃，pH?6.0-7.0。所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。

所述的重組體系在酶解木聚糖中的應用。

一種高溫木聚糖酶，氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質。

有益效果：與現有技術相比，本發明所提供的木聚糖酶具有極強的耐熱性能和弱酸性pH條件下高活性的特性，在90℃、pH?6.5的條件下酶活性最高，比酶活達到109?U/mg；該蛋白酶在溫度為75℃-100℃、pH為6.0-7.0的范圍內，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能極高，在65℃、pH?6.5的反應體系中，保溫2?h酶活穩定。上述特性使得本發明得到的木聚糖酶比現有木聚糖酶具有更大的優越性，適用于65℃以上高溫、弱酸性pH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業應用價值。

附圖說明

圖1是木聚糖酶Xyn10A-01的SDS-PAGE蛋白電泳圖；

圖2是Xyn10A-01活性隨溫度的變化結果圖；

圖3是Xyn10A-01活性隨pH的變化結果圖；

圖4是Xyn10A-01熱穩定變化結果圖；

圖5是Xyn10A-01降解櫸木木聚糖TLC圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。

以下實施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1?木聚糖酶基因xyn10A-01的制備

可采用如下人工合成的方式制備xyn10A-01基因，也可以以Thermotoga?thermarum的總DNA為模版通過PCR的方式得到。本研究的木聚糖酶基因xyn10A-01通過上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SEQ?ID?NO.2所示

實施例2?木聚糖酶基因xyn10A-01的亞克隆

用下述引物對PCR擴增實施例1中的木聚糖酶基因：

引物1：5’-?GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGA-3’?；