[發明專利]一種疏螺旋體BSK貯存液培養基及單菌落分離純化方法和應用

有效

• 申請號: 201310390968.5
• 申請日: 2013-08-30
• 公開（公告）號: CN103409356A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 葉美萍;樓永良
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12R1/01
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及醫學微生物學領域，具體涉及一種疏螺旋體BSK貯存液培養基，還涉及利用該貯存液培養基分離純化疏螺旋體單菌落的方法，還涉及該分離純化的方法在制備微生物學科研、臨床診斷中的單菌落及純培養物中的用途。

背景技術

單菌落分離和微生物純培養技術是微生物學科研、醫療、工業生產中最常見最重要的技術之一。含有一種以上的微生物培養物稱為混和培養物，如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養。在進行菌種鑒定、工業生產及科學研究時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。因為混合培養物中可能有多種來源不同的菌種，可能造成微生物培養物的異質性，表現為生物學性狀的不穩定，給工業生產帶來損失，并可能導致臨床診斷的錯誤。分離含有一種單一細菌的微生物學技術方法叫做單菌落分離，由單菌落而獲得純培養的過程稱為分離純化，常見的微生物單菌落分離及純培養的方法有以下幾種。

1、涂布平板法

首先把微生物懸液進行梯度的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養基表面上，培養箱倒置培養可以得到單個菌落。取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數次，便可得到純培養物。

2、平板劃線法

最簡單、常見的分離微生物單菌落的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進行劃線。當接種環在培養基表面上往后移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，其目的都是把細菌分散越開越好，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經培養后各自形成單個菌落，將單個菌落移種增殖后可得到純種細菌。該方法也是微生物單菌落分離最常見的方法。

3、富集培養法

通過創造特定的生長條件，如溫度、特殊營養成分、碳源、氮源、pH等，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重復移種，淘汰其它的微生物，最后富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。

疏螺旋體（Borrelia）為革蘭氏陰性細菌，該屬微生物具有5-10個疏而不規則的螺旋，運動活潑，易著色，微需氧，適溫為28-37度，人工培養較困難。該屬細菌包括多個人類的致病菌，如引起萊姆病的伯氏疏螺旋體（Borrelia?burgdorferi），由蜱傳播給人類。伯氏疏螺旋體的感染對人體多個系統有影響，經過不同的臨床階段，受影響的器官會發生長期的機能障礙；引起人類回歸熱的回歸熱疏螺旋體，根據回歸熱傳播媒介昆蟲的不同，可分為兩類。一為虱傳回歸熱，或稱流行性回歸熱，其病原體為回歸熱疏螺旋體(Borrelia?recurrentis)。另一為蜱傳回歸熱，又稱地方性回歸熱，其病原體多至15種，例如杜通疏螺旋體(Borrelia?duttonii)、赫姆斯疏螺旋體(Borrelia?hermsii)等。亞洲和中國流行的回歸熱主要是波斯疏螺旋體（Borrelia?persica）和拉氏疏螺旋體（Borrelia?latyschewii）。

疏螺旋體有著特殊的基因組結構特征，它的基因組是由一個線狀的約910kb的染色體和大約20個5-56kb大小不等的線狀或者環狀的質粒所組成。一些質粒在體外傳代培養過程是不穩定的，然而卻是維持在宿主動物體內具有感染性所必需的。遺傳上的異質性還可以來源于同一個克隆的衍生物，即質粒丟失后的后代，這些質粒編碼了重要的表型特征，例如抗原漂移以及NAD生物合成輔因子等。因此，疏螺旋體的單菌落分離和微生物純培養技術在該領域的菌種鑒定、分型、臨床診斷及科研中顯得更為重要。因為質粒丟失、或者發生同源重組后的克隆很可能對最后的鑒定、診斷、治療效果造成影響。