[發(fā)明專利]改性聚乙烯亞胺及其制備方法和基因轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310390436.1
• 申請日: 2013-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN104419004A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王志勇;謝麗斯;劉新;鄭海榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C08G73/04
• 分類號(hào): C08G73/04;C12N15/87;C12N15/85;C12N5/07
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因轉(zhuǎn)染生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種改性聚乙烯亞胺及其制備方法和基因轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

基因治療(gene?therapy)和基因修飾(gene?modification)是指將外源性功能基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正、補(bǔ)償或修飾生物體原有基因序列，改變基因表達(dá)功能，以滿足實(shí)驗(yàn)需求和疾病治療的目的。但是，外源性基因不能自行有效進(jìn)入靶細(xì)胞，需要借助基因遞送系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)。作為承載基因的工具，基因遞送系統(tǒng)能夠?qū)⒛康幕蛩腿氚屑?xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮目的基因的特定功能。

目前，基因遞送系統(tǒng)有兩大類：病毒類和非病毒類遞送系統(tǒng)。在病毒類遞送系統(tǒng)中，常見的病毒轉(zhuǎn)染體系主要包括逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、腺病毒、慢病毒和單純皰疹病毒等。雖然病毒遞送系統(tǒng)轉(zhuǎn)染率較高，但其制備難度較大、承載基因能力有限，并且存在與宿主基因組整合的潛在致病性危險(xiǎn)，從而限制了其在在實(shí)驗(yàn)室及臨床的應(yīng)用，并難以大范圍推廣。非病毒基因遞送系統(tǒng)中的陽離子聚合物，可通過靜電吸附負(fù)電性的核酸大分子，如質(zhì)粒DNA或者反義寡核苷酸，進(jìn)而形成微粒、膠束或者脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)基因的高效攜帶及細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染。

相對(duì)于病毒類基因遞送系統(tǒng)，聚乙烯亞胺(PEI)因其在體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效果好，且低成本，低免疫源性等優(yōu)點(diǎn)，成為目前應(yīng)用較廣泛的聚陽離子基因遞送系統(tǒng)，可以在較寬泛的pH范圍內(nèi)緊密結(jié)合大量功能核酸分子，并且載體攜帶基因在細(xì)胞內(nèi)吞后，由于PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生質(zhì)子海綿反應(yīng)，從而使溶酶體腫脹破裂，促使PEI和核酸的復(fù)合物得以釋放入細(xì)胞質(zhì)，很大程度上減少承載功能基因的核酸分子在吞噬泡內(nèi)富集并保護(hù)核酸分子使其不被降解，因而可以提高轉(zhuǎn)染率。PEI由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可以分為直鏈型和支鏈型，并且根據(jù)高分子特性，存在不同的分子量產(chǎn)品。但由于PEI自身化學(xué)結(jié)構(gòu)所引發(fā)的強(qiáng)正電荷特性，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中往往會(huì)引發(fā)細(xì)胞毒性，造成細(xì)胞凋亡。如高分子量支鏈聚乙烯亞胺(分子量25000g/mol，簡記為PEI25K)最具代表性。PEI25K是目前聚乙烯亞胺類基因遞送系統(tǒng)中，實(shí)驗(yàn)室推廣度最廣泛的聚陽離子基因遞送系統(tǒng)，其較高的正電荷密度能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞（如A549細(xì)胞，293T細(xì)胞等）實(shí)現(xiàn)相對(duì)較好的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，但這種高效轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染率也不足夠高而難以滿足應(yīng)用需求，同時(shí)也會(huì)引發(fā)較高的細(xì)胞毒性。

目前，為了提高轉(zhuǎn)染率和降低細(xì)胞毒性，多集中通過對(duì)PEI化學(xué)修飾改性。但現(xiàn)有的對(duì)PEI化學(xué)修飾改性的方法中，有的步驟較為繁瑣，不利于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模以及商品推廣，并且所得到的改性PEI的細(xì)胞毒性有所下降，但轉(zhuǎn)染性能并沒有得到數(shù)量級(jí)提高；有的需要大于100℃的高溫反應(yīng)，反應(yīng)期間需要嚴(yán)格的無水無氧苛刻條件，而且其中一些開環(huán)聚合修飾方法由于開環(huán)聚合自身反應(yīng)機(jī)理造成存在分子量分布狀況導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)分子量的精確調(diào)控，因而容易造成產(chǎn)品重復(fù)性差而難以保證獲得較高的轉(zhuǎn)染率和較低的細(xì)胞毒性。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，有必要提供一種基因轉(zhuǎn)染率較高、對(duì)細(xì)胞毒性較小的改性聚乙烯亞胺。

一種改性聚乙烯亞胺，包括作為主鏈的聚乙烯亞胺以及接枝在所述聚乙烯亞胺上的ε-己內(nèi)酯；所述ε-己內(nèi)酯與所述聚乙烯亞胺的伯胺氨基或仲胺氨基配位開環(huán)接枝，且未發(fā)生ε-己內(nèi)酯的配位開環(huán)聚合反應(yīng)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述聚乙烯亞胺的重均分子量為600g/mol～75000g/mol。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述改性聚乙烯亞胺的結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中x、y、z為非負(fù)整數(shù)，并且x、y和z均不為零，14≤x+y≤1744。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述改性聚乙烯亞胺的結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中，x、y為非負(fù)整數(shù)，并且x和y均不為零，14≤x+y≤1744。

一種改性聚乙烯亞胺的制備方法，包括如下步驟：

按質(zhì)量比為1:0.01～2.7將聚乙烯亞胺和ε-己內(nèi)酯加入溶劑中，并加入催化劑得到混合物，將所述混合物于15℃～35℃下攪拌5分鐘～30分鐘，然后加熱到沸騰，攪拌24小時(shí)～72小時(shí)，分離純化得到所述改性聚乙烯亞胺，所述改性聚乙烯亞胺包括作為主鏈的聚乙烯亞胺以及接枝在所述聚乙烯亞胺上的ε-己內(nèi)酯；所述ε-己內(nèi)酯與所述聚乙烯亞胺的伯胺氨基或仲胺氨基配位開環(huán)接枝，且未發(fā)生ε-己內(nèi)酯的配位開環(huán)聚合反應(yīng)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述溶劑為無水三氯甲烷。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述聚乙烯亞胺與所述溶劑的質(zhì)量比為1:10～200。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述催化劑為異辛酸亞錫。