[發明專利]脂肪干細胞及其干細胞分泌物的培養與量產方法

在審

• 申請號: 201310390387.1
• 申請日: 2013-08-30
• 公開（公告）號: CN104419659A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 蔡嘉櫸
• 申請（專利權）人: 翔宇生醫科技股份有限公司;蔡嘉櫸
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12P21/00
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶;於毓楨

技術領域

本發明涉及一種干細胞及其干細胞分泌物的培養與量產方法，特別是涉及一種脂肪干細胞的培養及量產其干細胞分泌物的方法。

背景技術

基于近年來生物科技與醫療技術的蓬勃發展，干細胞因其特有的分化、增生及組織修復潛能，使其在生物醫藥產業日趨重要。無論是從全球干細胞相關公司數量、市值的大幅成長，或是美國食品藥物管理局(FDA)接受以干細胞申請的臨床案件的逐年上升等情況來看，均顯示出干細胞治療已成為國際生物科技產業重點發展項目。

然而，干細胞的快速分化能力常使其在第3至4次繼代后，逐漸失去其干細胞特性，以致后續實驗往往無法符合臨床預期。即使是初代培養的干細胞，以傳統培養法的干細胞其特性也與臨床表現不同。此外，不同于骨髓干細胞、臍帶血干細胞及胚胎干細胞等檢測體來源取得較不容易，脂肪為相對容易的檢測體取得來源，且檢測體取得過程對捐贈者產生的不適感較其他來源輕緩。

此外，除了干細胞本身的醫療應用以外，越來越多針對干細胞分泌物的研究顯示，干細胞分泌物的復合組成因子對于再生醫學也有良好表現。歐美均有研究報導，以干細胞分泌物培養受損的肝臟細胞或其他哺乳類動物組織，均有細胞增生與組織修復的成果。

因此，現階段研究的首要目的即在于延緩干細胞分化、維持其干細胞特性并同時大量培養干細胞及其干細胞分泌物，以利后續研究。如何通過改良傳統干細胞培養方法，進而制造生產大量干細胞與其干細胞分泌物以符合當下細胞生物學界的需求，已成了亟待解決的一個課題。

發明內容

基于上述公知的問題及需求，本發明主要以不同于傳統細胞培養方式的創新3D培養法延緩細胞分化并維持干細胞特性，同時搭配定時灌流系統以刺激干細胞分泌物產生。由于3D立體環境培養法對干細胞特性的維持與其分泌物的組成分的影響，皆可應用于再生醫學且作為其他醫療領域的發展潛能。因此本發明以立體培養法制造生產大量干細胞與其干細胞分泌物符合當下細胞生物學界的需求。

本發明的一個目的為提供一種脂肪干細胞培養及量產其干細胞分泌物的方法，利用創新研發的3D培養技術大量培育脂肪干細胞且量產并收集其干細胞分泌物以利后期研究發展出個人化干細胞產品。

上述脂肪干細胞的培養方法的步驟包括：(A)收集脂肪細胞樣本；(B)分離該脂肪細胞樣本中的脂肪干細胞；(C)將該脂肪干細胞以干式細胞種植法分布于三維載體上，并置于一生物反應器中，以定時定量培養液灌流與細胞定時斷食法進行培養；(E)收集由該脂肪干細胞分泌的干細胞分泌物；其中該干細胞分泌物至少包括血管內皮生長因子(Vascular?endothelial?growth?factor,VEGF)、肝細胞生長因子(Hepatocyte?growth?factor,HGF)、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、1型膠原蛋白(collagen?type?I)其中之一或其組合。

在上述方法中，較佳地，步驟(C)進一步包括以定時定量培養液灌流與細胞定時斷食法進行培養；每個生物反應器裝載的三維載體的數目介于100～1500；培養獲取的脂肪干細胞總數量為1×10⁸～1×10⁹個/培養瓶。干細胞分泌物的血管內皮生長因子的濃度可介于0～2090pg/ml、肝細胞生長因子的濃度可介于0～1780pg/ml、介白素-6的濃度可介于0～523pg/ml、1型膠原蛋白的濃度可介于0～42ng/ml，，且脂肪干細胞在三維載體上的貼覆率較佳地可達到90%。

本發明相對于傳統細胞培養法有下列優勢：

通過三維培養脂肪干細胞的方法，可省去繁復操作步驟與人力、減少設備空間、量產干細胞分泌物以及節省細胞培養液的經濟成本。此外，干式細胞植入技術可改善以往3D培養法細胞貼覆率較差的瓶頸、并以定時定量培養液灌流與細胞定時斷食法，改變干細胞分泌物的組成及生產量，且在經濟效益方面可節約8至10倍的培養耗材用量與支出。通過本發明揭露內容，可快速大量培養脂肪干細胞及大量生產其干細胞分泌物，以提供疾病治療、細胞修復及再生醫學等領域的研究應用。獨創的細胞培養系統也可做為其他種類細胞培養的研究開發應用。

附圖說明

圖1為顯示本發明脂肪干細胞的培養方法的步驟流程圖；

圖2為脂肪干細胞的純化步驟流程圖；

圖3為脂肪干細胞的培養以及干細胞分泌物的生產步驟流程圖；

圖4顯示經純化培養后的脂肪干細胞存活率；

圖5顯示以干式細胞種植法將細胞液均勻分布于培養瓶中的三維載體后的細胞貼覆率；