[發(fā)明專利]京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310389232.6
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號: CN103435821A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 侯信;閆玉芳;尚躍再
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學
• 主分類號: C08J3/24
• 分類號: C08J3/24;C08J3/075;C08L89/00;C08K5/1545
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王秀奎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于高分子生物材料領(lǐng)域，涉及交聯(lián)改性彈性蛋白的方法，更具體的講，涉及利用京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)

彈性蛋白是一種重要的細胞外基質(zhì)蛋白，主要存在于韌帶、肺、大動脈及皮膚等經(jīng)常受力而變形的器官中，主要功能是為所在組織和器官提高抵抗反復壓縮和變形的能力。彈性蛋白作為細胞外基質(zhì)的主要成分，具有很好的生物相容性，但由于其高度不溶性導致難以加工成形，限制了在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用。因此通過對彈性蛋白進行酸降解得到的水解產(chǎn)物被頻繁應(yīng)用于合成彈性蛋白基復合材料。雖然酸降解后的結(jié)構(gòu)存在多樣性，但是其保持了彈性蛋白的氨基酸組成，仍然保持了彈性蛋白的諸多優(yōu)點。

同時，彈性蛋白酸降解產(chǎn)物具有自組裝和相轉(zhuǎn)變的特征。當溫度高于某一溫度時，其通過分子間氫鍵作用發(fā)生自組裝，從而導致發(fā)生凝聚，進而發(fā)生相分離。凝聚過程不僅受溫度影響，同時溶液的濃度、pH值、鹽濃度及雜質(zhì)的影響，這些因素主要通過影響分子間疏水基團作用影響凝聚過程。盡管如此，彈性蛋白基材料依然是一個有待于進一步深入研究的領(lǐng)域。

彈性蛋白酸降解產(chǎn)物雖然具有溫度敏感性，但是降解后彈性蛋白力學性能較差，故一般需要對降解后彈性蛋白進行改性才能進一步應(yīng)用。本實驗室成功的采用交聯(lián)方法制備彈性蛋白水凝膠。目前常利用的化學交聯(lián)劑有戊二醛，己二異氰酸酯，碳化二亞胺等，但是都具有很高的細胞毒性或交聯(lián)的組織在植入后產(chǎn)生鈣化現(xiàn)象。而京尼平作為交聯(lián)劑，不僅能形成穩(wěn)定的交聯(lián)制品，與戊二醛相比還具有細胞毒性小和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛等優(yōu)點，是一種非常有前途的交聯(lián)劑。所以本發(fā)明在此基礎(chǔ)上成功利用京尼平對彈性蛋白進行交聯(lián)同時制備出易于加工成形的彈性蛋白基水凝膠材料。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,采用京尼平交聯(lián)彈性蛋白方法制備彈性蛋白水凝膠，成功的通過交聯(lián)方法制備出易于加工成形的彈性蛋白基水凝膠材料,即在保持彈性蛋白生物相容性的基礎(chǔ)上，首先通過酸降解彈性蛋白制得水溶性彈性蛋白，然后采用京尼平對其進行交聯(lián)，探索彈性蛋白基水凝膠的制備方法及其性能研究。

本發(fā)明的技術(shù)目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn):

京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠，按照下述步驟進行：

步驟1，將α-彈性蛋白粉末后加入蒸餾水磁力攪拌下使其完全懸浮于水中；其中α-彈性蛋白溶液濃度為50-200mg/mL，攪拌時間為30min。

步驟2，將質(zhì)量分數(shù)為1%的京尼平水溶液加入步驟1制得的懸浮液中進行交聯(lián)反應(yīng)并定形，定形后用蒸餾水清洗表面未反應(yīng)的京尼平小分子至清洗完全，制得彈性蛋白水凝膠；其中所述京尼平與彈性蛋白質(zhì)量比為0.5-5%，優(yōu)選0.5-1%；交聯(lián)反應(yīng)溫度為10-20℃，時間為12-24h；定形溫度為37℃，時間為2-5h。

在步驟1中，選用的α-彈性蛋白可購于sigma，分子量為70—72KD（數(shù)均），也可根據(jù)文獻（Partridge?S?M,DavisH?F,Biochem.J.,61,21(1955)）按照如下步驟進行制備：

（1）用草酸溶液煮沸降解彈性蛋白，脫除脂肪及其他類型蛋白質(zhì)；

（2）用草酸溶液煮沸降解（1）制得的彈性蛋白至全部降解，得到水解彈性蛋白。

（3）使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)（2）所得的溶液pH值，收集沉淀。

（4）清洗（3）收集的沉淀，凍干，得到α-純凈彈性蛋白，備用。

在上述α-彈性蛋白的制備過程中，所述步驟（1）基質(zhì)材料為牛頸韌帶經(jīng)丙酮浸泡進行初步脫脂，浸泡時間為24h，并切成約5mm×5mm×5mm規(guī)則粒狀得到；所述的草酸溶液濃度為0.3-0.7mol/L，降解時間為30-60min；用蒸餾水洗凈表面油脂及其他類型蛋白質(zhì)。

所述步驟（2）所用草酸溶液濃度為1-2mol/L，降解時間為4-6h。

所述步驟（3）所用氫氧化鈉溶液濃度為1-6mol/L，調(diào)節(jié)pH值到4-5，彈性蛋白凝聚形成沉淀。

所述步驟（4）沉淀采用大量蒸餾水除去小分子物質(zhì)；凍干時間為24h；凍干后彈性蛋白研磨成細粉狀。

本發(fā)明的反應(yīng)原理為：京尼平上的烯碳原子受到彈性蛋白中游離氨基的親核進攻，開環(huán)形成雜環(huán)胺化合物，然后是京尼平上的酯基團與氨基反應(yīng)生成酰胺，同時釋放出甲醇，從而發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。

本發(fā)明將凍干彈性蛋白粉末與交聯(lián)后水凝膠進行掃描電鏡對比分析（如圖1和圖2所示），發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后彈性蛋白水凝膠具有明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而未交聯(lián)的彈性蛋白粉末呈現(xiàn)顆粒狀，由此可以證明彈性蛋白與京尼平發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。