[發明專利]一種殺蟲防病促生長的工程菌及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 201310387028.0
• 申請日: 2013-08-30
• 公開（公告）號: CN103484400A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 趙曉燕;李秀軍;楊合同;李紀順;張廷金;王貽蓮;孫文向;李文榮
• 申請（專利權）人: 昆明保騰生化技術有限公司;山東省科學院中日友好生物技術研究中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12N15/03;A01N63/02;A01P3/00;A01P7/04;A01P21/00
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 辛向東

1.一種殺蟲防病促生長的工程菌株TLB15，其特征在于由能夠防治蔬菜多種病害且對蔬菜具有促生長作用的枯草芽孢桿菌TL2和具有殺鱗翅目害蟲的蘇云金芽孢桿菌B7216構建的新菌株。

2.如權利要求1所述殺蟲防病促生長的工程菌株TLB15的構建方法，其特征在于應用熱-紫外滅活兩親本，通過損傷互補原理將兩個菌株的基因和優勢構建在一個新的菌株細胞內?，?獲得新的具有殺蟲防病促生長的多重功能的工程菌株TLB15。

3.如權利要求2所述殺蟲防病促生長的工程菌株TLB15的構建方法，其特征在于方法，包括下列操作步驟：

（1）兩親本菌體的制備

將枯草芽孢桿菌TL2和蘇云金芽孢桿菌B7216接種到斜面完全培養基，活化后立即取菌一環轉接至30mL液體完全培養基，于30℃恒溫搖床中培養24h，制得兩親本菌體；

（2）兩親本原生質體的制備

取步驟（1）培養的兩親株24h培養液將其培養至兩親本的對數生長期，鏡檢后將兩親本用SMM高滲緩沖液制成10³個/ml細菌的菌懸液，B7216菌懸液加入1.0mg/?mL的溶菌酶后酶解70min制得B7216原生質體，TL2菌懸液加入1.25mg/?mL的溶菌酶后酶解50min制得TL2原生質體；

（3）兩親本原生質體的融合

????取步驟（2）中制備的TL2原生質體懸浮液5ml置于小試管，在60℃水浴條件下水浴35min，使TL2原生質體的完全被滅活，取步驟（2）中制備的B7216原生質體懸浮液5ml置于小試管，在15W紫外燈下照射25min，垂直照射距離為30cm，使B7216原生質體的完全被滅活；

取滅活的兩親株原生質體各2ml混合,4000rpm離心15min，棄上清液，再向沉淀液中加入40%（w/v）PEG6000(在SMMD高滲液中加入40%的PEG6000，pH=7.0，用于原生質體的融合，)的SMMD溶液(SMM緩沖液中加DNA酶5ug/mL，臨時配制備用，在原生質體的融合過程中排除親本的轉化，)4ml與0.4ml的新生磷酸鈣溶液混合均勻，37℃水浴保溫10min得到融合的原生質體，

（4）融合子的再生與傳代培養

取步驟（3）中融合后的原生質體用SMM高滲緩沖液將融合液稀釋10倍，取0.1ml涂布于高滲基本再生培養基上，置于30℃恒溫箱中培養3天，得到了17個融合子，將獲得的17個融合子（簡稱為TLB1，TLB2，TLB3…………TLB17，）用牙簽點接于完全培養基平板上，放于30℃恒溫箱中培養24h后再影印到再生培養基平板上，傳代10次，鏡檢后用試管斜面保存；

（5）融合子的初篩

初篩采用平板拮抗試驗測定17個融合子對辣椒疫霉病和黃瓜枯萎病的抑菌作用，平板拮抗采用菌塊對峙培養法對已純化的17株內生細菌融合子進行篩選，初步選出TLB1，TLB2和TLB15三個菌株與親本的防病效果相當；

（6）融合子的復篩

復篩采用鏡檢晶體（因為晶體關系到融合菌株是否具有殺蟲作用）及對小菜蛾的殺蟲試驗，顯微鏡下觀察到只有TLB15產生晶體，且晶體量變少，不及親本B7216的晶體量，采用浸葉法測定生防菌株對小菜蛾的室內毒力測定，根據殺蟲試驗，復篩最后選出TLB15為穩定融合子。

4.如權利要求3所述的殺蟲防病促生長的工程菌株TLB15的構建方法,其特征在于所述步驟(2）中，B7216最合適的酶解濃度為1.0mg/ml，酶解時間為50min;TL2最合適的酶解濃度為1.25mg/ml,?酶解時間為50min。

5.如權利要求3所述的殺蟲防病促生長的工程菌株TLB15及其構建方法,其特征在于所述步驟(3）中，TL2原生質體熱滅活的時間為35min，B7216原生質體熱滅活時間的25min。

6.如權利要求1所述殺蟲防病促生長的TLB15的應用，其特征在于工程菌株TLB15經固態發酵后，經加工制得用于農業病、蟲害生物防治的可濕性粉劑。

7.如權利要求1所述殺蟲防病促生長的工程菌株TLB15的應用，其特征在于用于防治小菜蛾、黃瓜枯萎病、辣椒疫霉病及促進辣椒和黃瓜的生長。