[發(fā)明專利]一種抗菌肽及其制備方法與應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310386556.4
• 申請日: 2013-08-30
• 公開（公告）號: CN103436538A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 茆振川;張文玥;凌鍵;陳國華;楊宇紅;謝丙炎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/70;A01N47/44;A01P5/00
• 代理公司: 北京東正專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11312
• 代理人: 蔡仲德

1.一種抗菌肽，其特征在于，該抗菌肽的基因序列為抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列，該基因序列為：attcaaactg?atcatgttgc?cagcaatgct??atttctgaag??ctgcttattc??ctacaagaaa??atcgattgtg?ggggaaagtg??ttcagcgagg??tgccgattat??cgtcaaggcc??aagattgtgt?aagagggcat??gtggaacttg??ctgtgctaga??tgcaactgtg??ttcctcctgg?cacttctggc??aacactcaga??cttgcccttg??ctatgccaat??atgactactc?acggcaacag??acgcaaatgc??ccttaa。?

2.一種制備權(quán)利要求1所述抗菌肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟，(1)采用trizol方法提取辣椒葉片組織的總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄酶獲得第一鏈cDNA備用；?

(2)根據(jù)已知抗菌肽Snakin基因的序列，設(shè)計上游引物、下游引物，以第一鏈cDNA為模板，經(jīng)過PCR技術(shù)克隆得到抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列，并進行測序得到全長的基因序列，記為Sn基因序列；所述上游引物序列為5′ATT?CAA?ACT?GAT?CAT?GTT?GC3′，下游引物序列為5′TTA?AGG?GCA?TTT?GCG?TCT3′；?

(3)將(2)步得到的Sn基因序列克隆到原核表達載體pET28a(+)形成重組質(zhì)粒；?

(4)再將(3)步得到的全部重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α細菌感受態(tài)細胞中，從中篩選出重組成功的質(zhì)粒，記為pET-Sn；?

(5)將上步重組成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并采用IPTG進行誘導表達，使感受態(tài)細胞表達出抗菌肽，記為抗菌肽Sn，同時分泌出蛋白質(zhì)；?

(6)對(5)步分泌出蛋白的感受態(tài)細胞進行超聲波破碎，離心后收集上清液中的抗菌肽。?

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備抗菌肽的方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作方法為：①根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的馬鈴薯及擬南芥中的snakin家族基因序列，經(jīng)過生物信息學軟件分析出共同的保守區(qū)域，設(shè)計出上?游引物序列為5′ATT?CAA?ACT?GAT?CAT?GTT?GC3′、下游引物序列為5′TTA?AGG?GCA?TTT?GCG?TCT3′；?

②以第一鏈cDNA為模板，經(jīng)過PCR技術(shù)克隆得到抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列，PCR技術(shù)所使用的試劑盒，其成份包括：?

PCR擴增反應程序為，94℃預變性5min；94℃變性40?sec；63℃退火30?sec；72℃延伸1?min；35次循環(huán)，72℃延伸10?min；?

③對得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收，進行測序分析，確定出抗菌肽Snakin中無信號肽的基因編碼序列的全長序列，記為Sn基因序列，并推測獲得相應的氨基酸序列。?

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備抗菌肽的方法，其特征在于，所述步驟(3)得到重組質(zhì)粒的具體操作方法為，①提取原核表達載體pET-28a(+)的質(zhì)粒，并采用Eag?I和BamHI對質(zhì)粒進行雙酶切處理，同時將抗菌肽Snakin中的Sn基因序列采用相同的酶酶切下來，在37℃酶切4小時，然后通過瓊脂糖凝膠電泳將切下的質(zhì)粒與Sn基因序列條帶切膠回收，酶切質(zhì)粒的試劑包括：?

酶切Sn基因的試劑包括：?

②將酶切后的Sn基因與質(zhì)粒進行連接得到重組質(zhì)粒，在16℃反應過夜，連接所使用的試劑包括如下成份：?