[發明專利]一種發酵液中分離純化聚蘋果酸的方法

無效

• 申請號: 201310386478.8
• 申請日: 2013-08-30
• 公開（公告）號: CN103483561A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 劉國芝
• 申請（專利權）人: 西藏儷陽科技有限公司
• 主分類號: C08G63/06
• 分類號: C08G63/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種對生物發酵液中聚蘋果酸進行分離純化的方法，屬于生化工程領域。

背景技術

聚蘋果酸是一種特殊的脂肪族聚酯，以蘋果酸為唯一單體、相互通過酯鍵聯接而成。它是天然多聚物中新近開發的一種生物多聚物。與許多其它天然多聚物不同，聚蘋果酸分子中有許多自由羧基和非對稱碳原子，這些自由羧基賦予了它許多特別的性質，它除了具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性之外，還具有兩個顯著的優點：(1)易代謝性。由于L-蘋果酸是生物體內克雷伯氏三羧酸循環的中間體，β-聚蘋果酸容易在生物體內通過正常的三羧酸循環代謝途徑除去；(2)易修飾性。聚蘋果酸具有懸掛羧基，容易與其它官能團反應而制得聚蘋果酸衍生物，或引入功能基團或小分子藥物，從而制得許多具有特殊功能的產物。因此，聚蘋果酸及其衍生物可作為手術縫合線、組織工程支架材料、藥物載體或原生藥物、藥物控制釋放體系、食品包裝材料、化妝品等，在生物醫藥、食品、化妝品等領域獲得重要的應用，并且β-聚蘋果酸有和β-聚羥基脂肪酸酯相關的非常吸引人的功能組成，未來可能發現它的新的應用，比如可以制備優良的可降解塑料，解決當前危害嚴重的“白色污染”問題，甚至可以代替石油來源的不能被生物降解的聚丙烯酸的短期應用。可以預料，聚蘋果酸作為新型功能材料和生物結構材料定會獲得很大的發展。

聚蘋果酸能被某些微生物(真菌、黏菌、細菌等)先降解為低聚物，而后形成蘋果酸等單體，并最終降解為二氧化碳和水。聚蘋果酸的降解效率很快，在菌體內幾個小時就能被全部降解為單體。

聚蘋果酸的合成方法包括化學合成和微生物發酵法。通過化學合成可以得到3種類型的聚蘋果酸，即a、β、γ3種類型；而微生物發酵法得到的聚蘋果酸僅有β型。化學合成包括直接聚合法和內酯開環聚合法。化學合成方法的反應步驟復雜，化合時產生的副產物較多，分離較困難，而且含有毒物質(少量的催化劑)，制約了它的廣泛應用。同化學合成相比，微生物發酵合成的聚蘋果酸分子量較高，可達到200～760kDa，而化學合成的聚蘋果酸分子量一般低于7kDa。此外，生物合成所需的原料簡單易得，反應條件溫和，近年來受到國內外的廣泛關注。

國外對于聚蘋果酸及其衍生物的研究開始于20世紀60年代，對于其性質、用途及其合成方法都有研究，合成方法主要集中于化學法，據報道在國外已有規模化的生產。在國內，對于聚蘋果酸的研究非常少，相關報道也很少。迄今為止，以Vert、Cammas和Kajiyaina等為代表的國外學者已對聚蘋果酸的合成、性能和應用做了較深入的研究；國內直到近年來才有幾位學者對聚蘋果酸以及蘋果酸、乳酸共聚物的合成與性能做了一些基礎研究。盡管目前聚蘋果酸及其衍生物的研究遠不如對其他羥基烷酸酯的研究那樣深入，研究結果仍充分展示了這種新型的功能性脂肪族聚酯在生物醫藥、生物材料等領域的巨大應用前景。

短梗霉屬和P.polycephalum已經被優化培養以制備聚蘋果酸。細胞分泌多余的聚蘋果酸到發酵液中。由短梗霉屬合成的聚蘋果酸是以聚蘋果酸-葡聚糖結合體形式分泌的，另外還有一些被培養液中的酶分子為分子量5～11kDa的自由聚蘋果酸。由P.polycephalum合成的聚蘋果酸則是以純聚蘋果酸的形式分泌，分子量為50～300kDa。可以利用聚蘋果酸在丙酮中的高溶解性去除它連結的葡萄糖，而從短梗霉得到聚蘋果酸。保藏時間較長時，聚蘋果酸的主鏈的酯鍵被自發地水解切斷，使其分子具有不均一性。

聚蘋果酸以鈣鹽或鈉鹽的形式被分離和純化。聚蘋果酸鈣鹽是通過在過量CaCO₃或缺少CaCO₃的情況下用甲醇反復沉淀而分離的。聚蘋果酸的鈉鹽和鉀鹽是采用陰離子交換色譜分離得到的，流動相是KCl或NaCl，過量的鹽是通過Sephadex?G25而除去的。凍干樣品是無定形、無色的粉末，漿狀物和玻璃狀物。在通過Amberlite120(H⁺)轉化為酸，凍干，在溫熱(30℃-40℃)的丙酮中重新溶解后離心，減壓去除溶劑后，高純度的高分子看起來是玻璃狀的，幾分鐘后就形成結晶中心。從P.polycephalum得到的聚蘋果酸和它的鈉鹽是無色玻璃狀無定形粉末。

要實現發酵法制備聚蘋果酸的產業化，就必須對發酵液中的聚蘋果酸的提取工藝進行優化。國內外多采用有機溶劑沉淀法提取聚蘋果酸，但所得聚蘋果酸多為粗品，無法用于后續的應用研究中。

本發明建立了一種發酵液中分離純化聚蘋果酸的生產工藝，具有提取工藝簡單、能耗低、提取收率高、產品純度高的優點，可顯著降低從發酵液中提取聚蘋果酸的成本。

發明內容