[發(fā)明專利]一種豬萎縮性鼻炎滅活疫苗攻毒效檢方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310384961.2
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號(hào): CN104415353A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)S科;孫進(jìn)忠;田克恭
• 申請（專利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K49/00
• 分類號(hào): A61K49/00
• 代理公司: 北京華夏正合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種疫苗攻毒效檢方法。

背景技術(shù)

豬萎縮性鼻炎（atrophic?rhinitis,AR）是豬群的一種重要的呼吸系統(tǒng)傳染病，它會(huì)引起豬的慢性鼻炎、打噴嚏、流眼淚、顏部變性和鼻甲骨萎縮等癥狀，嚴(yán)重的還可以導(dǎo)致鼻吻變形并影響全身骨骼發(fā)育，從而導(dǎo)致豬生長遲緩，使豬容易感染繼發(fā)性復(fù)合性肺炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。該病可感染任何年齡階段的豬，其中4周齡以內(nèi)的豬感染率最高，癥狀一般出現(xiàn)在8-12周齡。豬萎縮性鼻炎通常是由支氣管敗血波氏桿菌（Bb）和多殺性巴氏桿菌（Pm）共同導(dǎo)致。其中，支氣管敗血波氏桿菌血清型單一，毒力相對穩(wěn)定，在萎縮性鼻炎病變中起打開鼻粘膜門戶的作用，進(jìn)而讓巴氏桿菌進(jìn)入豬體內(nèi)，造成萎縮性鼻炎的發(fā)生。

疫苗免疫是預(yù)防豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎有效的方法，現(xiàn)有的豬萎縮性鼻炎疫苗效檢方法為攻毒效檢和替代動(dòng)物測定抗體，其中攻毒效檢方法為免疫母豬對仔豬攻毒法，具體為含有支氣管敗血波氏桿菌（Bb）和多殺性巴氏桿菌（Pm）抗原成分的豬萎縮性鼻炎疫苗攻毒免疫母豬，同時(shí)設(shè)置未免疫母豬對照組，免疫母豬所產(chǎn)仔豬連同未免疫母豬所產(chǎn)仔豬7日齡先Bb攻毒，10日齡進(jìn)行Pm攻毒，42日齡處理仔豬觀察結(jié)果。但尚未有用含有支氣管敗血波氏桿菌（Bb）和多殺性巴氏桿菌（Pm）抗原成分的豬萎縮性鼻炎疫苗免疫仔豬后，來檢測攻毒效檢的方法。

并且，不同來源的多殺性巴氏桿菌菌株毒力也不完全相同，加上血清型眾多，造成了在攻毒效檢時(shí)無法準(zhǔn)確的判斷出攻毒的劑量，以致于攻毒效檢失敗，攻毒模型無法建立，進(jìn)而無法準(zhǔn)確判斷出疫苗的效力。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種豬萎縮性鼻炎滅活疫苗攻毒效檢方法，所述方法不僅解決了不同毒力多殺性巴氏桿菌細(xì)菌造成攻毒劑量無法準(zhǔn)確判斷的問題，還有效解決了仔豬免疫豬萎縮性鼻炎滅活疫苗后免疫效果評價(jià)的問題。

本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬萎縮性鼻炎滅活疫苗攻毒效檢方法，所述方法包括：產(chǎn)毒素巴氏桿菌攻毒劑量的確定步驟，以及對仔豬免疫后攻毒效檢步驟。

優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步包括攻毒菌毒液的制備步驟，所述攻毒菌毒液的制備步驟包括將支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏桿菌菌種分別于固體培養(yǎng)基平面活化，分別挑取所述支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏桿菌單克隆于培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲菌液；對所述支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏桿菌菌液細(xì)菌計(jì)數(shù)，確定菌液活菌含量。

更優(yōu)選地，所述支氣管敗血波氏桿菌為支氣管敗血波氏桿菌HN8株，所述多殺性巴氏桿菌為多殺性巴氏桿菌D型HB4株。

支氣管敗血波氏桿菌HN8株（Bordetella?bronchiseptica?HN8）保藏號(hào)為：CCTCC?NO.M2011223，多殺性巴氏桿菌D型HB4株（Pasteurella?multocida?D?Type?HB4）保藏號(hào)為：CCTCC?NO.M2011221，保藏日期均為2011年06月28日，保藏地址均為：中國武漢，武漢大學(xué)；保藏單位均為中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC）。

更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏桿菌單克隆菌株的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基。

使用本發(fā)明攻毒菌毒液的制備方法進(jìn)行菌液的培養(yǎng)，預(yù)估出的活菌含量準(zhǔn)確性更高，對定量攻毒劑量的準(zhǔn)確性有很大的提升。

優(yōu)選地，所述多殺性巴氏桿菌攻毒劑量的確定步驟包括通過多殺性巴氏桿菌對小鼠半數(shù)致死量確定多殺性巴氏桿菌對仔豬每鼻孔攻毒劑量。

更優(yōu)選地，其中所述多殺性巴氏桿菌對仔豬每鼻孔攻毒劑量/多殺性巴氏桿菌對小鼠半數(shù)致死量為1～2×10³～1～2×10⁴。

優(yōu)選地，所述對仔豬免疫后攻毒效檢步驟包括：在免疫組仔豬免疫二免后用支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏菌病毒混合液連同攻毒對照組仔豬進(jìn)行鼻內(nèi)攻毒，兩個(gè)鼻孔同時(shí)攻毒；最后一次攻毒后35日解剖仔豬，對仔豬鼻甲骨萎縮情況進(jìn)行評分，攻毒對照組至少80%仔豬鼻甲骨萎縮分?jǐn)?shù)在8分及以上，免疫組仔豬鼻甲骨萎縮平均分?jǐn)?shù)比攻毒對照組仔豬鼻甲骨萎縮平均分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低。

所述統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低為免疫組仔豬鼻甲骨萎縮平均分?jǐn)?shù)比攻毒對照組仔豬鼻甲骨萎縮得分通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05，差異顯著。

更優(yōu)選地，所述仔豬免疫二免后第21天、第24天和第25天連續(xù)攻毒。