[發明專利]一種基于豬CD163基因的雙熒光素酶報告基因載體

有效

• 申請號: 201310384901.0
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號: CN103468730A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 吳俊靜;梅書棋;彭先文;喬木;武華玉;劉貴生;宋忠旭;孫華;李良華;李明波;董斌科
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/11;C12N15/66
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種基于豬CD163基因的雙熒光素酶報告基因載體psi-CHECK2-CD163-3UTR，其特征在于：該載體包含SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列，該序列位于豬CD163基因的3’UTR區。

2.一種擴增豬CD163基因cDNA3’末端的上游引物，其特征在于：所述引物的DNA序列如下所示：

外引物：CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC，

內引物：GCCTGAAAGCAGATGAAACGGA。

3.一種擴增豬CD163基因469bp片段的引物對，其特征在于：所述引物對的DNA序列如下所示：

上游引物：CCGCTCGAGTCGCTCATCTTTTGTTGC，

下游引物：ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG。

4.一種用于非診斷目的的基于豬CD163基因的雙熒光素酶報告基因載體psi-CHECK2-CD163-3UTR的制備方法，其特征在于：該載體通過以下步驟制備得到：

（1）參考豬CD163基因cDNA序列，利用cDNA3’末端快速擴增結合槽式降落PCR克隆獲得豬CD163基因完整3’UTR片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

（2）利用生物信息學工具TargenScan，預測調控豬CD163基因表達的物種間保守microRNAs及靶位點序列，對比擴增的豬3’UTR區序列，尋找包含保守microRNAs的靶位點序列TGAATGT和AATGTGA；

（3）結合豬CD163基因CDS和SEQ?ID?NO：3所示核苷酸序列，設計包含microRNAs的靶位點序列的一對引物，該引物對的DNA序列如SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5所示，利用PCR擴增豬CD163基因，得到如SEQ?ID?NO：6所示的核苷酸序列，其長度為469bp；

（4）將步驟（3）擴增的序列插入雙熒光素酶報告基因載體psi-CHECK2中，通過酶切、連接、轉化感受態細胞、篩選陽性克隆并測序驗證、抽提重組質粒DNA并做雙酶切鑒定，獲得豬CD163基因雙熒光素酶報告基因載體psi-CHECK2-CD163-3UTR，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：7所示。