[發(fā)明專利]一種有機磷農(nóng)藥降解酶突變體及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310384286.3
• 申請日: 2012-11-13
• 公開（公告）號: CN103409387A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐建華;胡德峰;徐卡爾·翰
• 申請（專利權(quán)）人: 紹興華泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/81;C12N15/85
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 徐飛虎;徐關(guān)壽

1.一種有機磷農(nóng)藥降解酶突變體，所述突變體的氨基酸序列如Seq?ID?No.13所述；其中所述Seq?ID?No.13中第116個氨基酸X₁為蛋氨酸（M）、異亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機磷農(nóng)藥降解酶突變體，其特征在于：其中所述Seq?ID?No.13中第116個氨基酸X₁為蛋氨酸（M），該突變體的氨基酸序列如Seq?ID?No.11所述。

3.編碼如權(quán)利要求1所述的有機磷農(nóng)藥降解酶突變體蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如Seq?ID?No.12所述；所述序列Seq?ID?No.12中第346-348位的核苷酸N₁N₂N₃為分別編碼蛋氨酸（M）、異亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）的密碼子。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因序列Seq?ID?No.12中第346-348位的核苷酸N₁N₂N₃為編碼蛋氨酸（M）的密碼子。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于：所述突變體基因的核苷酸序列如Seq?ID?No.10所述。

6.攜帶有如權(quán)利要求3-5任一項所述基因序列的載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，所述的載體選自酵母表達載體pPICZ-α-A、pHIL-D₂、pPIC9或pHIL-S₁，動物細胞表達載體pSVK3或pMSG。

8.一種宿主系統(tǒng)，其由權(quán)利要求6所述的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染酵母、哺乳動物細胞或細菌宿主得到。

9.一種制備如權(quán)利要求1所述有機磷農(nóng)藥降解酶突變體蛋白的方法，所述方法包括如下步驟：

（1）在有機磷農(nóng)藥降解酶突變體基因的兩端引入限制性酶切位點，通過酶切操作連接到酵母表達載體上，

（2）將表達載體轉(zhuǎn)化導入酵母菌中，經(jīng)篩選得到重組基因工程菌；

（3）高密度發(fā)酵重組酵母菌，誘導表達后離心收集發(fā)酵上清液，經(jīng)分離純化獲得重組有機磷農(nóng)藥降解酶突變體蛋白。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法步驟（3）中，高密度發(fā)酵重組酵母菌可分兩個階段，第一階段主要用于菌體（或細胞）的生長，第二階段主要用于誘導表達目標產(chǎn)物。