[發明專利]一種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法

有效

• 申請號: 201310382669.7
• 申請日: 2013-08-21
• 公開（公告）號: CN103451110A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 張岳平;陳光宇;羅紹春;周勁松;湯泳萍;黃燕萍
• 申請（專利權）人: 江西省農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，其特征在于，具體操作步驟如下：?

(1)、制備蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液：?

挑取蘆筍莖枯病菌Phomopsis?asparagi菌絲一環，接種在由50mL燕麥瓊脂培養基制成的固體斜面上，在溫度25℃、光照12h／d條件下培養10-14d，待出現成熟的蘆筍莖枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL無菌蒸餾水洗孢子，得到含有孢子團塊的孢子液，用移液器將該孢子液振蕩打碎孢子團塊，過濾，取濾液進行倍比稀釋，顯微鏡下計數，得到濃度為1×10⁶個／mL的蘆筍莖枯病菌分生孢子懸液；?

(2)、制備新鮮菌絲體：?

將制備好的分生孢子懸液接種于液體完全培養基中，25℃條件下150r／min搖床培養72h，漏斗過濾，獲得新鮮菌絲體；?

(3)、酶解菌絲細胞壁：?

取1.0g新鮮菌絲體，加入10mL裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶的混合酶液，33℃水浴酶解4.5h，采用1.0mol／L?MgSO₄(10m?mol／L?pH6.98的PBS配制，體積比為MgSO₄：PBS=3∶1)做滲透壓穩定劑時，原生質體數量達到2.8×10⁷個／mL；?

(4)、原生質體分離：?

過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液于溫度4℃、轉速5000r／min、離心分離5min；棄上清液，用1-2mL濃度1.0mo1／L的山梨醇溶液洗滌2-3次，收集原生質體重懸于1mL濃度1.0mol／L預冷的山梨醇溶液中保存，得到原生質體懸液；?

(5)、原生質體再生：?

將原生質體懸液用濃度0.6mol／L的蔗糖溶液稀釋100倍，取稀釋液0.1mL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板；溫度25℃、保持相對濕度60％-75％、光照培養12h／d，培養3-5d直至長出直徑約1mm再生菌落；調查再生情況，對形成的菌落記數(A)；以?不含穩滲劑的PDA培養基作對照(B)。計算再生率，再生率(％)=(A-B)×100／總原生質體數。?

2.根據權利要求1所述的一種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，其特征在于，所述的步驟(3)混合酶液由下列重量配比的物質組成：裂解酶15g／L、崩潰酶10g／L、蝸牛酶15g／L、溶劑為1.0mol／L?MgSO₄(10m?mol／L?pH6.98的PBS配制，體積比為MgSO₄：PBS=3：1)，配置好后用直徑為0.45μm的超微微孔濾膜過濾除菌。?

3.根據權利要求1所述的一種蘆筍莖枯病菌原生質體制備與再生方法，其特征在于，所述的步驟(5)中的高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基由下列重量配比的物質組成：馬鈴薯200g／L，葡萄糖20g／L，瓊脂20g／L，蔗糖205g／L。?