[發(fā)明專(zhuān)利]一種細(xì)菌CD-126發(fā)酵液及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310382605.7
• 申請(qǐng)日: 2013-08-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103484500A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李國(guó)紅;徐優(yōu)耀;張克勤;王芯
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P1/04
• 分類(lèi)號(hào): C12P1/04;C12N1/14;C12R1/37;C12R1/645
• 代理公司: 昆明今威專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域:

本發(fā)明涉及一種細(xì)菌CD-126發(fā)酵液及其應(yīng)用，屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù):

植物寄生線蟲(chóng)是植物的重要病害之一，據(jù)估計(jì)全球每年由植物寄生線蟲(chóng)所造成的作物損失達(dá)1570億美元(Abad?et?al.2008)，線蟲(chóng)病害成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的限制因子之一。目前對(duì)線蟲(chóng)病害的防治仍然以化學(xué)防治為主，但由于化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響以及寄生線蟲(chóng)抗藥性的增加，利用線蟲(chóng)天敵進(jìn)行生物防治備受關(guān)注。捕食線蟲(chóng)真菌（Nematode-trapping?fungi）是自然界中控制線蟲(chóng)種群數(shù)量的一類(lèi)重要的真菌生物因子，它們利用營(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成的捕食器官，如收縮環(huán)、非收縮環(huán)、粘性菌絲、粘性分枝、及三維菌網(wǎng)完成對(duì)線蟲(chóng)的捕捉和侵染。捕食線蟲(chóng)真菌的捕食器官是其侵染植物寄生線蟲(chóng)的必要條件之一，捕食器官在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基上能夠自發(fā)產(chǎn)生，也能夠通過(guò)環(huán)境因子（氨基酸和多肽等）的誘導(dǎo)產(chǎn)生。

經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻(xiàn)的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)菌CD-126發(fā)酵液及其應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明使用的細(xì)菌菌株是變形桿菌（Proteus?sp.）CD-126,菌株CD-126已于2012年7月12日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏號(hào)：CGMCC?No.6357。

1.細(xì)菌CD-126的保存

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的組成和配制方法如下:

LB培養(yǎng)基：稱(chēng)取胰蛋白胨10g，酵母粉5g和NaCl10g用去離子水溶解并定容至1L，調(diào)節(jié)PH到7.0，加入20g瓊脂，121℃滅菌20分鐘。

細(xì)菌CD-126保存在LB固體培養(yǎng)基上。

2.捕食線蟲(chóng)真菌寡孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys?oligospora）的培養(yǎng)

a.培養(yǎng)基：

CMA培養(yǎng)基：稱(chēng)取20g玉米顆粒,加入1000mL自來(lái)水,煮沸20分鐘,用四層紗布過(guò)濾收集液體，加入20g瓊脂，再定容到1L，121℃滅菌20分鐘。

b.寡孢節(jié)叢孢的活化和孢子培養(yǎng)：在CMA固體培養(yǎng)基上接種寡孢節(jié)叢孢，26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天，以得到大量的孢子。用無(wú)菌水沖洗CMA平板上的寡孢節(jié)叢孢菌絲；用移液器將平板上的液體轉(zhuǎn)移至裝有無(wú)菌擦鏡紙的漏斗內(nèi)過(guò)濾，收集孢子，制備孢子懸液；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子液內(nèi)的孢子濃度。

3.細(xì)菌CD-126發(fā)酵液的制備

在裝有5-10ml?LB液體培養(yǎng)基的試管中接種細(xì)菌CD-126，25℃～38℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)24-72小時(shí)。發(fā)酵液用高速離心機(jī)在10000rpm下離心5min分離菌液和菌體，吸取上清液放在-4℃的冰箱中備用，得到本發(fā)明使用的活性發(fā)酵液

4.捕食線蟲(chóng)真菌寡孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys?oligospora）捕食器官的誘導(dǎo)

收集得到寡孢節(jié)叢孢的孢子，實(shí)驗(yàn)組（三維菌網(wǎng)誘導(dǎo)組）在水瓊脂平板上加入CD-126上清液，將上清液和孢子懸液（1:1，v/v）混勻涂在平板上；對(duì)照組（培養(yǎng)基）平板上加入LB液體培養(yǎng)基和孢子懸液（1:1，v/v）混勻涂布；將兩組平板靜置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用光學(xué)顯微鏡（Olympus,Japan）觀察誘導(dǎo)產(chǎn)生的捕食器官（三維菌網(wǎng)）的形態(tài)。

5.細(xì)菌CD-126發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)寡孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys?oligospora）捕食器官的誘導(dǎo)

用酒精和紫外殺菌處理過(guò)的兩格平板作為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，在其中一個(gè)格里面倒入滅菌水瓊脂。將寡孢節(jié)叢孢的孢子鋪在水瓊脂平板上，在另一個(gè)空格中加入細(xì)菌發(fā)酵液，同時(shí)做培養(yǎng)基對(duì)照。用光學(xué)顯微鏡（Olympus,Japan）觀察誘導(dǎo)產(chǎn)生的捕食器官(三維菌網(wǎng))的形態(tài)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：利用細(xì)菌快速誘導(dǎo)捕食線蟲(chóng)真菌產(chǎn)生捕食器官，明顯提高了捕食線蟲(chóng)真菌捕食線蟲(chóng)的能力。

附圖說(shuō)明：

附圖1：捕食線蟲(chóng)真菌(寡孢節(jié)叢孢)的捕食器官誘導(dǎo)（光學(xué)顯微鏡照片）

具體實(shí)施方式：

以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實(shí)施例的細(xì)菌CD-126發(fā)酵液的制備過(guò)程同發(fā)明內(nèi)容部分的描述。

實(shí)施例1：細(xì)菌CD-126發(fā)酵液對(duì)寡孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys?oligospora）捕食器官的誘導(dǎo)。