[發(fā)明專利]使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310380474.9
• 申請(qǐng)日: 2013-08-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103462724A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程蕾;陳洪波;胡修忠;辛友東;凌明湖;劉曉華;高揚(yáng)澤;王定發(fā);夏瑜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): A61D19/02
• 分類號(hào): A61D19/02
• 代理公司: 武漢楚天專利事務(wù)所 42113
• 代理人: 楊宣仙

1.使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，依次包括牛冷凍精液的前期處理、受精前精液的獲能處理和與加入卵母細(xì)胞的受精滴進(jìn)行體外受精三個(gè)階段，其特征在于：在第一階段牛冷凍精液的前期處理中使用的SP-TALP洗滌液洗滌時(shí)向含有牛精液的SP-TALP洗滌液中加入含有1‰DMSO的染料木黃酮，或在第二階段受精前精液的獲能處理階段中向含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE獲能液的混合液內(nèi)加入含有1‰DMSO的染料木黃酮，或在第三階段體外受精過(guò)程中制備含有卵母細(xì)胞的受精滴時(shí)加入含有1‰DMSO的染料木黃酮；其中每支牛冷凍精液的受精過(guò)程中，前兩個(gè)階段中加入含有1‰DMSO的染料木黃酮時(shí)，染料木黃酮在加入液體中的終濃度為10μmol/L；在第三個(gè)階段加入含有1‰DMSO的染料木黃酮時(shí)，染料木黃酮在含有卵母細(xì)胞的受精滴與牛精液混合液中的終濃度為10μmol/L。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于在第一階段牛冷凍精液的前期處理中加入染料木黃酮的具體過(guò)程是：取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中以1500-2000r/min的速度離心5-8min，棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻，并向牛精液和SP-TALP洗滌液的混合液中加入含有1‰DMSO的染料木黃酮，致使染料木黃酮在含有牛精液的SP-TALP洗滌液中的終濃度為10μmol/L，然后放入37℃、5%CO₂和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中溫育2-3個(gè)小時(shí)，然后再次收集到離心管中以1500-1700r/min的速度離心5-10min，棄上清液，保留沉淀100-120μL，再用IVF-TALP受精液調(diào)整精子濃度為3×10⁶個(gè)/mL～4×10⁶個(gè)/mL，之后放入37℃，5%CO₂和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫芫埃瑢⑻幚砗玫呐＞号cPHE獲能液按照體積比17:13的比例混合后并與含有5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟牛卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合按照正常的受精過(guò)程進(jìn)行體外受精。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用染料木黃酮提高牛冷凍精液精子運(yùn)動(dòng)性及體外受精率的方法，其特征在于在第二階段受精前精液的獲能處理中加入含有染料木黃酮的具體過(guò)程是：取一支牛冷凍精液，將其解凍后收集至離心管中以1500-2000r/min的速度離心5-8min，棄上清液，然后按照1:1的體積比加入SP-TALP洗滌液中混合均勻后放入37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中溫育2-3小時(shí)，再次收集到離心管中以1500-1700r/min的速度離心5-10min，棄上清液，保留沉淀100-120_μL，然后加入IVF-TALP受精液中調(diào)整精子的濃度為3×10⁶個(gè)/mL～4×10⁶個(gè)/mL放入37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中備用，受精前，將處理好的含有牛精液的IVF-TALP受精液與PHE獲能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合獲能液，向混合獲能液內(nèi)添加含有1‰DMSO的染料木黃酮，致使染料木黃酮在含有牛精液的混合獲能液中的終濃度為10μmol/L，之后將其放入37℃，5%CO₂和100%飽和蒸汽的培養(yǎng)箱中備用，待卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，便可與含有5-6枚經(jīng)體外培養(yǎng)成熟牛卵母細(xì)胞的受精滴等體積混合后按照正常的受精過(guò)程進(jìn)行體外受精。