[發明專利]一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 201310379690.1
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN103468631A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 張岳平;陳光宇;羅紹春;周勁松;湯泳萍;黃燕萍;謝啟鑫;趙萍
• 申請（專利權）人: 江西省農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法，其特征在于包括下列操作步驟：

(1)選取長10-15cm的羊齒天門冬嫩筍，剝掉鱗片，剪去頂端鱗片包被的部分，切成2-3cm小段，并用刀片削去表皮；

(2)在自來水下輕輕擦洗10min；

(3)于無菌操作臺中，通過75％酒精消毒5min，用無菌蒸餾水沖洗2次；

(4)用10％的次氯酸鈉消毒10min，用無菌蒸餾水沖洗4次；

(5)用無菌棉布吸干嫩筍表面蒸餾水，將上述嫩筍小段切成0.1-0.2cm薄片，無菌條件下稱量1.0g置于50mL無菌試管中；

(6)在試管中加入10mL纖維素酶、果膠酶和蝸牛酶的混合酶液，于25℃-28℃遮光的搖床上100rpm進行振蕩酶解，滲透壓穩定劑組成成分為：0.1％MES+0.2％的CaCl₂·2H₂O+0.8mol／L葡萄糖，配置好后用直徑為0.45μm的超微微孔濾膜過濾除菌；所述混合酶液由下列重量配比的物質組成：纖維素酶5g／L、果膠酶3g／L、蝸牛酶5g／L、滲透壓穩定劑；

(7)酶解結束后，用200目不銹鋼濾網過濾酶液，除去未被酶解的剩余組織樣品，獲得含有該原生質體的過濾液，濾液于溫度4℃、轉速3000-4000r／min、離心分離5-10min，使原生質體沉淀；棄上清液，用濃度0.8mol／L的蔗糖溶液洗滌1-2次，保留沉降的原生質體；原生質體純化采用KMG溶液和蔗糖密度離心法，在離心管中加入0.8mol／L的蔗糖8ml，并于管壁小心加入KMG溶液2ml，溫度4℃下3000-4000r／min離心5-10min，收集懸浮于兩液相之間的蔗糖溶液頂部形成的原生質體帶；稀釋至一定體積后進行計數，測定原生質體產量。

2.根據權利要求1所述的一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法，其特征在于：步驟(6)的酶解條件為酶液pH值為5.8，溫度保持25℃-28℃，遮光的搖床上100rpm進行振蕩酶解，混和酶液組成為纖維素酶5g／L、果膠酶3g／L、蝸牛酶5g／L，滲透壓穩定劑為0.1％MES+0.2％的CaCl2·2H2O+0.8mol／L葡萄糖，酶解時間4.0h。

3.根據權利要求1所述的一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法，其特征在于：所述KMG溶液為改進的KM培養基，其中葡萄糖濃度為0.75mol／L。