[發明專利]L-肉堿脫氫酶的提純方法

無效

• 申請號: 201310378666.6
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN103436503A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 錢江;馬曉航;錢峰;張鵬程
• 申請（專利權）人: 寧波賽克生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12R1/01
• 代理公司: 余姚德盛專利代理事務所(普通合伙) 33239
• 代理人: 胡小永

技術領域

本發明屬于生化領域，具體地，本發明涉及L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法。?

背景技術

L-肉堿（L-carnitine），別名L-肉毒堿、維生素Bt、左卡尼汀等，化學名為L-β-羥基-γ-三甲胺丁酸，是人體內必需的一種類維生素化合物。自從1973年Engel報告第一例人類CN缺乏癥(CD)以來，有關L-肉堿的生理生化，CD的病理和臨床報告日漸增多，成為臨床醫學和營養學的一個重要課題。L-肉堿作為藥物治療由CD引起的各種疾病取得了很好的效果，其生產方法的改進和創新對于L-肉堿的大規模生產具有重要意義。目前生產L-肉堿的方法中，酶轉化法具有環境友好、成本低、產品安全性高等特點，是較有吸引力的方法。?

在酶轉化法中，L-肉堿脫氫酶(EC1.1.1.108)是所需要的一個重要的酶，因此它的性質對該方法的使用和推廣非常重要。雖然已有少量文獻對此類酶進行了報道，但在這些已報道的酶中，大多數都存在著酶活和專一性不高的問題。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法。該方法制備的L-肉堿脫氫酶產物的酶活7.49U/ml，比活達到2.848U/mg。?

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是：L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法，包括以下步驟：?

（1）L-肉堿脫氫酶粗酶液的獲得：?

①菌株發酵：?

菌株活化：將Ochrobactrum屬的一株能產優良性質的L-肉堿脫氫酶(EC1.1.1.108)的菌株L-3菌株接入斜面培養基30℃培養20-30h進行活化；?

一級培養：再將活化后的菌株接一環到液體培養基，培養條件為：100mL錐形瓶中裝液20mL，30℃，搖床轉數180rpm，培養24小時；?

二級培養：然后以1%的接種量將菌液加入到液體培養基中，在與一級培養相同培養條件下培養24h；?

三級培養，15L發酵罐中裝10L的液體培養基發酵27h，發酵的條件：發酵溫度30℃，攪拌速度180rpm，pH6.5；?

②發酵液的濃縮處理?

將發酵結束后的發酵液8000rpm離心30min收集菌體，并用50mmol/L，pH7.0的PB緩沖液洗滌細胞一次；洗滌完之后，將所得的菌體懸浮于500mL?PB緩沖液中，用高壓均質機進行破壁，之后8000rpm離心30min去除細胞壁碎片，即得粗酶液，4℃下保存；?

（2）L-肉堿脫氫酶的純化?

①硫酸銨分級鹽析?

在所述粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末，使飽和度分別達到35%、45%、55%、65%，同時不斷調節pH使其穩定在7.0，鹽析過夜，在每個濃度都將粗酶液以8000rpm離心30min，在沉淀中以1：2的比例加入50mmol/L，pH7.0的PB緩沖液后測酶活和蛋白含量，將比活較高的部分收集起來裝入透析袋，用0.01mol/L，pH8.0的Tris-HCl緩沖液與4℃下透析，每隔12小時換一次透析液，換三次；透析結束后8000rpm離心30分鐘取上清以用于下一步的純化；?

②DEAE-cellulose離子交換層析?

DEAE-cellulose層析柱（5.5×50cm）先用0.01mol/L，pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡，再將透析后的酶液上此離子交換柱，用NaCl濃度為0到1mol/L的0.01mol/L，pH8.0的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，流速為1mL/min，15min收集一管；用Folin-酚法測定各管蛋?白含量和測定各管酶活；將比活較高的幾管收集合并。?

所述斜面培養基的成分為：1.0%L-肉堿，1.0%酵母膏，1.0%葡萄糖，0.2%三水磷酸氫二鉀，0.05%磷酸二氫鉀,，0.05%七水硫酸鎂，1.0%(v/v)微量元素液，1.5%瓊脂粉，pH7.0。?

所述液體培養基的成分為：0.5%L-肉堿，0.1%酵母膏，0.2%葡萄糖，0.2%三水磷酸氫二鉀，0.05%磷酸二氫鉀,，0.05%七水硫酸鎂，1.0%(v/v)微量元素液，1.5%瓊脂粉，pH6.5。?

本發明與現有技術相比，具有如下優點：?

（1）本發明L-肉堿脫氫酶經過鹽析和DEAE-Cellulose離子交換層析后純化倍數達到104.7倍，酶活7.49U/ml，比活達到2.848U/mg。?

（2）本發明工藝簡單，易操作，生產成本低。?

附圖說明