[發(fā)明專利]一種無動物來源成分的細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310377955.4
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN103436486A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 齊念民;馮見;陳彥田
• 申請（專利權(quán)）人: 上海瀚正生物技術(shù)服務(wù)有限公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生化工程和動物細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，特別涉及一種無動物來源成分的含有氨基酸或者多肽配給以及細(xì)胞粘附因子的微載體以及其制備方法和其用于細(xì)胞培養(yǎng)的方法。

背景技術(shù)

微載體培養(yǎng)技術(shù)于1967年被用于動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。經(jīng)過幾十余年的發(fā)展，該技術(shù)目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞。

良好的細(xì)胞培養(yǎng)微載體具有以下特點(diǎn)：表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；可用簡單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長情況；簡化了細(xì)胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，重現(xiàn)性好；培養(yǎng)基利用率較高；放大容易；細(xì)胞收獲過程不復(fù)雜；勞動強(qiáng)度小；培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。

貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長和擴(kuò)展成單層三個階段。細(xì)胞只有黏附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的黏附是進(jìn)一步鋪展和生長的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性以及微載體表面理化性質(zhì)等。

目前市面上常用的微載體有兩類，他們都是帶有不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián)而成的大分子，一類是以帶正電荷的化合物DEAE（二乙氨乙基Diethylaminoethyl）作為配基，用于一般的動物細(xì)胞培養(yǎng)，比如GE的Cytodex1，另一類是利用變形的動物明膠-豬膠原蛋白作為配基，通過共價交聯(lián)在葡聚糖微球表面，為細(xì)胞的貼壁生長提供附著，從而增加細(xì)胞粘附和增值，該載體更適用于一些不容易貼附的細(xì)胞培養(yǎng)。

經(jīng)過文獻(xiàn)檢索，Beum?Jun?Kim等在《Batch,?fed-batch,?and?microcarrier?cultures?with?CHO?cell?lines?in?a?pressure-cycle?driven?miniaturized?bioreactor.?Biotechnol?Bioeng.2012?Jan;109(1):137-45》中利用小規(guī)模化的生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞生產(chǎn)用于商業(yè)目的的人源IgG，雖然與傳統(tǒng)的滾瓶培養(yǎng)相比能有效的提高靶蛋白產(chǎn)量，但是其仍然使用的是表面包被動物來源蛋白的Cytodex?3，不利于下游純化。

目前已經(jīng)有的動物細(xì)胞培養(yǎng)用微載體大多數(shù)以動物膠原及其衍生物作為包被材料，為克服因應(yīng)用含有動物來源成分的微載體于動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中而帶來引入病毒的風(fēng)險以及由此引起的產(chǎn)品申報和監(jiān)管困難，市場上迫切需要一種不含有動物膠原等動物源材料作為配基的新型細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，以建立在整個過程中無動物來源成分的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和方案。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種無動物來源成分的含有氨基酸或者多肽配基的微載體及其制備方法和其用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法，將該微載體用于動物細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞在微載體表面可以快速附著和擴(kuò)展，有利于細(xì)胞的高密度生長，因?yàn)椴灰雱游镌葱猿煞郑朔思?xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中因引入動物來源成分可能帶來的產(chǎn)品質(zhì)量及安全性問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種無動物來源成分的細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，由配基和三維載體基質(zhì)通過交聯(lián)劑交聯(lián)而成，所述配基為氨基酸聚合物或者人工合成的多肽或者促細(xì)胞粘附蛋白，所述配基交聯(lián)于所述三維載體基質(zhì)的表面。

優(yōu)選地，所述三維載體基質(zhì)的材料選自葡聚糖，殼聚糖，海藻酸鈉，聚2-羥乙基甲基丙烯酸中的一種或幾種。

一種上述的無動物來源成分的細(xì)胞培養(yǎng)用微載體的制備方法，包括以下步驟：

1）?采用表面化學(xué)修飾試劑處理三維載體基質(zhì)，在其表面生成活性基團(tuán)；

????其中，三維載體基質(zhì)表面的活性基團(tuán)優(yōu)選包括鹵代原子、氯甲基、溴甲基、氨基中的一種或幾種，優(yōu)選表面化學(xué)修飾試劑選自2-氯丙酰氯、2-溴丙酰溴、2-溴丁酰溴、3-氨甲基硅烷、2-氯丁酰氯中的一種或幾種。這些活性基團(tuán)具有很好的接枝處理性能。表面化學(xué)修飾試劑與三維載體基質(zhì)反應(yīng)的溫度為60-100℃，反應(yīng)時間為2-5h，采用的溶劑為水或其他自由液，反應(yīng)物的濃度為1-20?mg/ml，在無氧條件下進(jìn)行。采用其它修飾試劑時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)一般知識進(jìn)行反應(yīng)條件的選取；