[發明專利]miRNA檢測探針、試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310377483.2
• 申請日: 2013-08-26
• 公開（公告）號: CN104419751B
• 公開（公告）日: 2016-10-12
• 發明（設計）人: 陳昌華;陳菲;許昌有
• 申請（專利權）人: 益善生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;曾鳳云

技術領域

本發明屬于分子生物學、醫學和生物技術領域，尤其涉及一種miRNA檢測探針、試劑盒及其檢測方法。

背景技術

microRNA（miRNA）是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA，一個miRNA可有很多靶基因，而每個基因受多個miRNA調控。研究發現，編碼調控miRNA的基因發生突變、缺失以及轉錄后調控失衡、啟動子區DNA甲基化修飾及結合蛋白異常等引起miRNA的異常表達。miRNA表達異常會嚴重影響細胞信號轉導途徑的功效，導致細胞增殖和分化失去控制。針對miRNA的檢測對于分子水平的基因表達的監控有重要意義，也可以為miRNA功能研究提供重要依據。

目前miRNA的檢測方法主要有Northern?Blot、原位雜交、基因芯片、熒光定量探針法；但NorthernBlot方法敏感度低、耗時長且RNA的用量較大，不適合高通量分析；原位雜交技術在一次實驗過程只能檢測有限的miRNA，仍然難以滿足高通量要求；基因芯片技術能實現miRNA的高通量分析，即在一塊芯片上同時檢測多個miRNA，但缺點是結果準確性低，重復性差，實驗價格昂貴。熒光定量探針法檢測靈敏度高，但檢測費用昂貴；而基于微球的流式細胞術技術將探針固定于微球上并置于液相中，更有利于捕獲miRNA序列，因此提高了準確性，但是由于miRNA同源性高，長度較短，細胞或組織內含量低，針對它的高靈敏高選擇性檢測方法仍然有待進一步完善。

發明內容

本發明的目的之一提供了一種用于miRNA檢測的探針。

實現上述目的的具體技術方案如下：

一種miRNA檢測探針，包括：

（1）雜交探針：其5'端為tag標簽序列，3'端為結合序列，所述tag標簽序列和所述結合序列之間還設有待檢測靶標miRNA反向互補序列；所述結合序列為polyA序列或為oligoCCA序列，其長度為8-20個堿基；

（2）信號探針：其5'端為信號序列，3'端為polyT或oligoTGG；所述polyT或oligoTGG是雜交探針中結合序列的反向互補序列；所述信號序列為Oligo?GT、Oligo?TG或Oligo?GTT序列，其長度為60-90個堿基。

在其中一些實施例中，所述結合序列的長度為9-11個堿基。最優選為10個堿基。

在其中一些實施例中，所述信號序列的長度為為89-90個堿基。最優選為90個堿基。

本發明的另一目的是提供一種miRNA檢測試劑盒。該檢測試劑盒能夠高靈敏高選擇性檢測靶標序列。

一種miRNA檢測試劑盒，包括以下組份：

A、上述檢測探針；

B、包被有anti-tag序列的微珠，所述anti-tag序列與雜交探針5’端的tag序

列互補配對。

在其中一個實施例中，miRNA檢測試劑盒還包括有生物素標記的dCTP、dATP、dTTP或dGTP。

在其中一些實施例中，所述tag序列選自SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.5中的一條或多條。

在其中一些實施例中，步驟（2）所述anti-tag序列與微珠之間連接有間隔臂序列，優選地，所述間隔臂序列為5～10個T的間隔臂序列。

本發明的另一個目的是提供一種檢測miRNA的方法，該方法能實現目標miRNA的準確檢測。

實現上述目的的技術方案如下。

一種檢測miRNA的方法，包括以下步驟：

1）使用本發明上述檢測探針中的雜交探針和信號探針，與生物素標記的dCTP、dATP、dTTP或dGTP進行延伸反應，形成信號標記復合體；

2）與待檢測的樣本雜交；

3）加入上述包被有anti-tag序列的微珠進行捕獲反應；

4）RNase酶切消化；

5）用SA-PE進行孵育，檢測。

本發明的主要優點在于：

1）本發明的miRNA檢測探針構建方法，能夠適用于不同的目標檢測miRNA，靈敏度高，特異性好，適用性強。