[發明專利]一種鼠傷寒沙門氏菌的核酸檢測方法

有效

• 申請號: 201310376175.8
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103571943A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 程安春;黃靜瑋;汪銘書;陳孝躍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鼠傷寒沙門氏菌的核酸檢測方法，其特征在于，通過使用特異性引物，利用環介導等溫擴增技術體系擴增靶基因的特定區域，其具體步驟為：

(1).根據鼠傷寒沙門氏菌STM4493基因設計的環介導等溫擴增引物；

(2).提取待檢測樣品DNA及陽性對照鼠傷寒沙門氏菌STM4493基因組DNA或其它鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA、或含檢測靶序列的重組質粒DNA；

(3).鼠傷寒沙門氏菌LAMP檢測的反應體系組成如下：

2xU-LAMP反應混合液10μl，其組成為：40mM?Tris-HCl、pH8.8、20mM?KCl、20mM(NH₄)₂SO₄、10mM?MgSO₄、0.2％Triton?X-100、2.4mM?dNTPs、1.6M甜菜堿；10x引物混合液1μl，其組成為：F3為2μM，B3為2μM，BIP為12μM，FIP為12μM，LF為3μM，LB為3μM，；模板DNA1μl、Bst聚合酶0.75μl、補水至20μl，同時設置陰陽性對照擴增體系，陰陽性對照擴增體系除模板外，其余成分同上述檢測反應體系；

(4).特定的程序為：64.0℃45min→80℃5min→-20℃保存；

(5).LAMP反應結束LAMP反應結果進行的分析及判定的方法包括：

①肉眼直接觀察反應濁度

②瓊脂糖凝膠電泳分析

③肉眼觀察反應液顏色的變化.

所述述3種方法中可選一種或多種作為判斷標準，其中：

①肉眼直接觀察反應管內溶液的濁度變化：在核酸的合成過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與Mg²⁺結合，產生焦磷酸鎂沉淀，且隨反應的進行沉淀量加大，在反應結束后，可直接通過肉眼判讀，反應液出現渾濁沉淀，則說明該管擴增反應為陽性；反之，則為陰性；

②瓊脂糖凝膠電泳分析：取LAMP擴增產物5μl，在2％的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，在紫外燈照射下出現典型的梯狀條帶，則說明該管擴增反應為陽性；反之，則為陰性；

③加入1/1000的Sybrgreen?I染料觀察反應液顏色變化或者紫外照射下檢測熒光：如果含有擴增產物，反應混合液為綠色，否則保持Sybrgreen?I的橙色不變；在紫外照射的條件下，能夠檢測到熒光則為陽性；反之，則為陰性。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，利用環介導等溫擴增技術擴增鼠傷寒沙門氏菌的特定靶核酸序列區域。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中所述的陰陽性對照擴增體系中，陽性對照模板為含有鼠傷寒沙門氏菌STM4493基因組DNA或其它鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA或含檢測靶序列的重組質粒DNA，陰性對照的模板為滅菌超純水，并使用電泳分析或Sybrgreen?I熒光染料紫外燈下顯色同時檢測陰陽對照擴增產物。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，針對鼠傷寒沙門氏菌中的Genbank登錄號為NC_003197.1的STM4493基因設計環介導等溫擴增特異性引物。