[發(fā)明專利]一種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310375667.5
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103436526A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設計）人: 岳巧云;胡佳;邱德義;陳健;劉德星;魏曉雅;吳可量;劉國雄
• 申請（專利權）人: 岳巧云
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）、DNA模板的制備：取一只極微小動物個體或動物個體的部分組織，加入裂解液，研磨，95℃放置10min，4000rpm短暫離心5s，然后加入緩沖液，所加入的緩沖液與裂解液的體積比為0～9：1，95℃放置10min，12000rpm離心1min，棄沉淀，所得的上清液即為極微量樣品的DNA溶液；所述裂解液為10～100mM的NaOH溶液，所述緩沖液，其成分及制備方法為：100mM?Tris，1M?KCl，10mM?EDTA，調pH為9.5，高壓滅菌；

（2）、DNA條形碼序列的擴增：以步驟（1）的極微量樣品的DNA溶液為模板，采用正向引物LCO1490:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’和反向引物HCO2198:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’進行PCR擴增，即得到極微量樣品的DNA條形碼序列。

2.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的動物個體的部分組織，重量為10μg。

3.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的裂解液為50mM的NaOH溶液。

4.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的緩沖液與裂解液的體積比為1：9。

5.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的步驟（2）的PCR擴增，其擴增反應體系為：2×KOD?FX?DNA聚合酶buffer25μl，2mM?dNTP10μl，KOD?FX?DNA聚合酶1μl，20mM正向引物LCO1490和20mM反向引物HCO2198各1μl，DNA模板2μl，加ddH₂O補足至50μl。

6.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的步驟（2）的PCR擴增，其擴增反應條件為：95℃3min；98℃10s，50℃30s，68℃1min，35個循環(huán)；68℃7min。

7.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的極微量樣品為螨、蚤、蜱的單個個體或蠅的部分組織。

8.一種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的試劑盒，包括裂解液、緩沖液、DNA聚合酶buffer、正向引物LCO1490、反向引物HCO2198、dNTP、KOD?FX?DNA聚合酶，其特征在于，所述的裂解液為10～100mM的NaOH溶液，所述的緩沖液其成分及制備方法為：100mM?Tris，1M?KCl，10mM?EDTA，調pH為9.5，高壓滅菌。

9.根據權利要求8所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的試劑盒，其特征在于，所述的裂解液為50mM的NaOH溶液。