[發明專利]一種微液滴式PCR芯片及其制作方法

有效

• 申請號: 201310374364.1
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103451088A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 張衛平;駱健;崔峰;劉武;曹井通;陳文元;吳校生
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中;樊昕

技術領域

本發明涉及生物醫學應用儀器領域，具體地，涉及一種微液滴式PCR芯片及其制作方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)，或稱無細胞克隆技術(Free?bacteria?cloning?technique)，作為分子生物學和基因工程的一項重要技術，其是一種在引物引導下選擇性擴增DNA和RNA片段的方法，具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點。現階段生物工程采用的PCR擴增儀可對所需要的目的基因片段進行連續多次擴增，并可以復制到幾百萬倍數量級的數目，廣泛應用于以獲得目的基因或基因片段為目的的生命科學，醫學工程，遺傳功臣，疾病診斷等許多領域。

微液滴技術在生物化學領域迅速發展，基于微液滴技術可以操控微小體積的液滴，并可以實現微液滴的穩定生成、表面處理、破裂、融合及多層液滴制備，因此微液滴可用于容器進行微生物培養、反應酶分析、微球顆粒的形成等。

經檢索發現，一種集成溫度控制PCR-CE微流控芯片及其制作方法（中國專利公開號103103120A），此專利中描述了一種傳統PCR芯片的結構及制作方法。

相對于傳統的PCR芯片，微液滴式PCR芯片具有產出PCR反應液滴的粒徑穩定、均一并且可操控性強的特點，因此能夠較為方便快捷的形成反應酶、反應物與催化劑等物質的融合。

微流控芯片的通道尺寸在微米級別，因此液體流動為低雷諾數層流狀態。因此可以利用這種流動效果進行生物化學實驗，但是在微通道中實驗又有自己本身的缺點，如微腔室的試劑的混合效果不好、樣本的需求量大、分析的靈敏度低、在混合過程因為混合通道的流體流速不同造成混合不均勻等。而微液滴的提出，主要是針對試劑混合出現的各種問題，利用兩種相間不相容的原理，將試劑混合后形成均一穩定的大分子粒子，并在另一相間進行PCR反應，這樣使混合充分，不會造成混合通道的堵塞，充分利用反應樣本試劑，提高了反應物的PCR合成的效率。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種微液滴式PCR芯片及其制備方法，根據本發明制作出一種以微液滴形式反應的PCR芯片，更為有效的形成尺寸均一、單分散性和數量實驗條件有具體要求的PCR液滴，具有較快形成大量PCR液滴、實時性強、制作成本低等特點。

根據本發明的一個方面，提供一種微液滴式PCR芯片，該芯片采用雙層設計，上層為PDMS圖形化蓋片，下層為玻璃基底，上、下兩層采用真空氧等離子體鍵合封裝為一個完整的微液滴PCR芯片；

所述PDMS圖形化蓋片從左到右依次包括：DNA目標片段與引物注入口、單相液滴成型微結構、PCR反應酶和mRNA底物注入口、油相試劑注入口、液滴直線通道、十字混合通道、微液滴緩沖通道、微液滴PCR反應腔室及微液滴PCR廢液腔室，其中：DNA目標片段與引物注入口、PCR反應酶和mRNA底物注入口、油相試劑注入口為并行的3個試劑注入口，每個注入口均設置有單相液滴成型微結構；液滴直線通道、十字混合通道、液滴緩沖通道為從左至右相互連接的試劑混合與流通通道；微液滴PCR反應腔室與液滴緩沖通道相連，微液滴PCR廢液腔室與微液滴PCR反應腔室相連。

本發明中上層PDMS圖形化蓋片采用負膠顯影圖形化，PMDS倒模得到；將油相試劑通過油相試劑注入口注入，并通過油相試劑注入口流過十字混合通道與微液滴緩沖通道，進入微液滴PCR反應腔室，這樣油相試劑就會預先浸沒整個混合區域，為后續得到PCR微液滴創造一個連續環境；再將DNA目標片段及DNA引物和PCR反應酶、mRNA底物分別注入到DNA目標片段與引物注入口、PCR反應酶和mRNA底物注入口，流經單相液滴成型微結構，利用單相液滴成型微結構的多層過濾特性將大分子物質濾出，大分子物質逐一分離得到均一穩定的單相液滴；液滴通過液滴直線通道形成粒徑大小相同的或相近的物質，待通過液滴直線通道后和十字混合通道的油相環境混合，由于十字混合通道的尺寸逐步變小，便會因為毛細作用將PCR反應的各個大分子物質包裹一層油相物質，進而形成微環境獨立的微液滴結構；微液滴通過微液滴緩沖通道穩定后，儲存在微液滴PCR反應腔室中，并為后續的PCR反應提供微液滴環境和相應試劑物質。微液滴PCR廢液腔室用于儲存進樣時多余的試劑，同時作為PCR反應完畢后的廢液排出口。