[發明專利]棉蚜特異性SS-COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201310373835.7
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103436618A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 王倩;楊帆;陸宴輝;楊益眾
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及棉蚜特異性SS-COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。

背景技術

棉蚜（Aphis?gossypii?Glover），俗稱膩蟲、蜜蟲、油蟲，屬同翅目，蚜科，蚜屬，是一種世界性害蟲，除西藏外，在全國各地都有發生，其中以黃河流域和西北內陸棉區發生危害較重。棉蚜的寄主范圍廣泛，全世界已知寄主植物74科285種，我國已記載113種，其中越冬寄主主要為木槿、花椒、石榴、鼠李等，夏季寄主有棉花及瓜類、茄科、豆科、菊科和十字花科植物等。棉蚜的成蚜、若蚜都主要集中在棉葉背面或嫩頭吸食汁液。苗期受害，棉葉卷縮，棉株生長發育緩慢，中部葉片出現油葉，葉表蚜蟲排泄的蜜露常誘發霉菌滋生，嚴重時導致蕾鈴脫落。

田間棉蚜有多種捕食性天敵（如瓢蟲、草蛉等），其保護和利用是棉蚜防治的重要措施。其中，明確捕食性天敵對棉蚜的捕食作用，對于分析田間食物鏈營養關系及篩選優勢天敵種類等具有指導意義。天敵捕食關系研究的方法很多，包括直接觀察法、解剖觀察法、田間系統調查及相關分析、實驗種群觀察與分析、食痕與標記法等。但是，這些方法都存在相應的缺陷，如：費時、費力、花費較高、不易成功等。

Species-Specific-COI?PCR檢測技術是在mtDNACOI技術的基礎上發展起來的特異序列擴增區域標記，是利用特異性的引物，根據預期DNA條帶的有無來判斷檢測結果，無需測序和序列比對，具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便且重現性和穩定性強等優點。這為天敵對棉蚜捕食作用的定性與定量分析提供了可能。

發明內容

本發明的目的是提供棉蚜特異性SS-COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。

為了實現本發明目的，本發明根據棉蚜的線粒體DNA序列，設計一對棉蚜特異性SS-COI引物，其包括：

正向引物LFAgF：5'-CAGATATATCTTTTCCACGAC-3’

反向引物LFAgR：5’-TTAAAATTGATCATGGAAATAG-3’。

本發明還提供含有引物LFAgF和LFAgR的用于檢測棉蚜的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液中的至少一種。優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。

本發明還提供所述引物LFAgF和LFAgR，以及含有引物LFAgF和LFAgR的試劑盒在檢測棉蚜中的應用。

本發明還提供一種棉蚜的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟：

1）提取樣品DNA；

2）以步驟1）提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物LFAgF和LFAgR進行PCR擴增反應；

3）分析PCR產物。

PCR反應體系以20μL計為：

PCR反應條件為：94℃4分鐘；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共45個循環；72℃1秒。

對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現大小為300bp的DNA擴增條帶（SEQ?ID?No.3），則判定樣品為棉蚜。

本發明根據GenBank中公布的棉蚜COI（AB506730）的一段基因序列，設計一對特異性引物，該引物特異性強，只對棉蚜具有擴增能力，而對棉田中的其它昆蟲無擴增產物。采用本發明提供的方法和引物檢測棉蚜，準確性高，可擴增出300bp大小的片段。采用SS-COI?PCR技術檢測棉蚜，是對RAPD技術、RFLP技術和mtDNA?COI檢測技術的補充和改進，SS-COI?PCR檢測技術操作簡單、快速、高效，一般可在5個小時內完成檢測，且具有較高的靈敏度，質粒濃度檢出限為5.27E+04，DNA濃度檢出限為0.179ng/μL。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中棉蚜特異性引物LFAgF/LFAgR的PCR檢測結果；其中，M：DNA分子量標準2000bp?ladder；1-114為表1中序號所對應昆蟲的擴增結果，-為陰性對照。

圖2為本發明實施例2中棉蚜特異性引物LFAgF/LFAgR的DNA濃度梯度檢測結果；其中，M：DNA分子量標準5000bp?ladder；1-8為模板DNA濃度179ng/μL依次10倍稀釋濃度梯度；-為陰性對照。