[發明專利]一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細胞的定量檢測方法

無效

• 申請號: 201310373444.5
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103436590A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 曾新安;王滿生;孫大文;韓忠;劉志偉
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12R1/865
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 陳文姬

技術領域

本發明涉及液體食品中微生物的檢測方法，特別涉及一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細胞的定量檢測方法。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，是與人類關系最廣泛的一種微生物，與同為真核生物的動物和植物細胞具有很多相同的結構，且易培養，在現代分子和細胞生物學中常被用作研究真核生物的模式生物，其作用相當于原核的模式生物大腸桿菌。

釀酒酵母作為基礎生物學研究和食品工業中廣泛應用的菌種，是良好的研究模型，但同時它也是液體食品中的常見污染菌種，并會因為酒精發酵和CO₂氣體的產出而引起飲料等食品的腐敗。此外，當前熱門的非熱殺菌的技術手段，如脈沖電場（PEF）技術等，在用于液體食品殺菌時仍存在著殺菌不徹底的現象，也就是說液體食品物料經殺菌技術處理后的微生物存在著亞致死損傷狀態。而微生物的亞致死損傷是一種可逆損傷，在適宜條件下會恢復其原來活性。因此，對經非熱殺菌處理后的食品進行亞致死損傷細胞的定量檢測就顯得十分必要，因為亞致死損傷的細胞在適當條件下可自我修復，重新恢復其活性，從而對相應食品的衛生安全及貨架期產生嚴重威脅，故需進一步強化滅菌條件才能滿足殺菌效果、達到衛生要求，從而延長非熱殺菌產品貨架期。從另一方面講，釀酒酵母細胞在亞致死應激條件下會作出相應的反應應答，從而產生相應的代謝產物，且有些代謝產物對人類發揮著重要作用，如酵母細胞在高鹽條件下會大量積累海藻糖等物質。因此，如何最大限度地獲取亞致死損傷狀態細胞則成了當前迫切需要解決的問題，而對亞致死損傷細胞進行定量檢測則可以有效優化亞致死損傷的處理條件。

許多研究表明，釀酒酵母細胞經PEF技術等手段處理后往往會產生亞致死損傷細胞，而對于亞致死損傷的細胞，一般可以通過流式細胞儀結合熒光染色技術來實現在線檢測其存在與否，但該方法技術在設備方面投資成本較高，而且對操作技術的要求也相對較高，關鍵是不能對亞致死損傷細胞進行初步定量分析。另外，對亞致死損傷細胞進行選擇性篩選原理上也能定量檢測出其相對數量，但對于選擇性篩選條件的確定卻存在一定的困難。

中國發明專利200410017149.7公布了一種實時定量PCR檢測血液樣品中癌細胞的方法。中國發明專利200610048468.3公布了一種大腸桿菌近紅外光譜快速檢測技術。中國發明專利200810135561.7公布了一種醬油等調味品中菌落總數快速檢測方法。200810150350.0公布了一種環境水體中腸道病毒的定量檢測方法。中國發明專利201010173244.1公布了一種調味品中大腸菌群的快速檢測方法。中國發明專利201010173224.4公布了一種食品中大腸菌群的快速檢測方法。中國發明專利201010180339.6公布了一種利用流式細胞儀檢測腹腔吞噬細胞活性的方法。中國發明專利201110356426.7公布了一種有效殺滅高壓脈沖電場處理食品中亞致死微生物延長貨架期的方法。但是上述專利涉及的方法存在如下問題：（1）上述專利基本上都是針對完整的細胞（即未受損傷的）進行表征檢測，而沒有針對應激處理條件下亞致死損傷細胞進行定量檢測；（2）上述專利中所述方法有些雖然能用于亞致死損傷細胞的檢測，但在使用過程中往往成本較高，而且操作也較復雜，關鍵是不能對亞致死損傷細胞進行初步定量分析，如流式細胞儀檢測需要結合染色技術等。

發明內容

為了克服現有技術的上述缺點與不足，本發明的目的在于提供一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細胞的檢測方法，能夠定量檢測分析亞致死損傷細胞數量，操作程序簡單、價廉、適于規模化應用。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細胞的定量檢測方法，包括以下步驟：

（1）將經脈沖電場處理過的待測液體進行不同濃度梯度稀釋，得到不同稀釋度的稀釋液；

（2）制備釀酒酵母亞致死細胞的臨界水分活度下的選擇性培養基與非選擇性培養基；

所述釀酒酵母亞致死細胞的臨界水分活度下的選擇性培養基的制備過程如下：

在麥芽汁營養瓊脂中加入蒸餾水，充分攪拌溶解后加熱至沸騰，得到溶劑；然后加入氯化鈉固體，充分溶解后分裝滅菌，冷卻至45～50℃得釀酒酵母亞致死細胞的臨界水分活度下的選擇性培養基；所述氯化鈉固體與溶劑的質量體積比為4.0%～4.5%g/L；

（3）選取合適的稀釋度的稀釋液，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟（2）制備的選擇性培養基和非選擇性培養基進行平板計數培養；