[發明專利]一種染色鑒別泡菜生花真菌性病原菌的方法

在審

• 申請號: 201310373131.X
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN104422609A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 張政
• 申請（專利權）人: 張政
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N21/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于食品技術領域，具體是提供一種簡單且準確的利用染色鑒別泡菜生花真菌性病原菌的方法。

背景技術

泡菜是指將蔬菜經過預處理后直接浸泡在一定濃度的食鹽溶液中通過自身所含微生物或人工接種的乳酸菌進行乳酸發酵并伴隨著酒精發酵和醋酸發酵而形成的有特殊風味的發酵制品泡菜的制作方法簡單成本低廉風味獨特口感好是大眾所喜歡的腌制菜之一同時泡菜還有抗菌、凈腸、預防動脈硬化、減肥和抗衰老等作用。

泡菜中的微生物有多種，其中乳酸菌對泡菜品質起著決定性的作用，而其他雜菌(如腸桿菌霉菌等)會破壞泡菜的品質，這些腐敗菌產生的毒素和亞硝酸鹽等會危害人的健康?！吧ā辈『褪桥莶松a過程中最常見的病害之一。“生花”也叫產膜，俗稱“臭風”，常出現在啤酒、醬油、果汁、葡萄酒及泡菜的生產過程中。泡菜在發酵過程中，表面飄浮一層白色膜狀物質，并使泡菜帶有不愉快氣味，發酵時間延長，且容易引發一系列其它變質現象。生產現場調查表明：泡菜“生花”對泡菜風味影響很大，泡菜會散發一種令人不愉悅的氣味，而且會產生澀味，口感比正常發酵泡菜差很多。

目前，國內外還沒有學者對泡菜“生花”進行比較系統的研究。人們對泡菜“生花”的認識主要還停留在生產過程中遇到的“生花”現象，引起泡菜“生花”的病原菌以及其作用機理尚未見詳細報道。食品的品質很大程度上與所含微生物的數量有關，其所含有害微生物越多，品質越差，對人體健康越有危害大部分微生物是病原微生物，與人類的發病和傳播有密切關系，在食品制造中，應盡量減少有害微生物的數量。在實際生產中，鑒別生花泡菜的方法只能依靠工人的生產經驗人工進行病害泡菜的挑選和分離。真菌性病原菌是生花病害常見的危害菌和重要污染指標。

因此提供一種簡單且準確的鑒別泡菜生花真菌性病原菌的方法具有非常重要意義。

發明內容

本發明通過觀察疑似“生花”真菌性病原菌的細胞核和子囊孢子染色的結果，對該病害微生物進行鑒定。技術方案分為細胞核的染色鑒定和子囊孢子的染色鑒定兩部分，具體為一種染色鑒別泡菜生花病害微生物的方法，包括細胞核的染色鑒定和子囊孢子的染色鑒定；

所述細胞核的染色鑒定步驟為：菌懸液涂片→干燥→石油醚脫蠟→乙醇溶液沖洗→蘇木精液染色32～40min→水洗11～15min→酸水或酸乙醇分色→乙醇或水沖洗數小時→置堿水或堿乙醇中變藍→1.2～1.5％伊紅溶液復染→各級乙醇脫水→二甲苯透明→鏡檢；

其中，制片脫蠟后用乙醇溶液沖洗，先用無水乙醇沖洗，再分別用濃度遞減的乙醇溶液沖洗，直至用蒸餾水沖洗；分色和堿液變藍過程使用酸液和堿液來完成；復染后，用濃度從低到高直至無水乙醇進行脫水。

所述子囊孢子的染色鑒定步驟為：將疑似菌接種于孟加拉紅液體培養基→30～40℃恒溫培養25～36h→連續轉接2次→再轉接到肉汁蛋白胨培養基中→25～28℃恒溫培養4～7d→取菌懸液涂片→干燥→飽和孔雀綠水溶液染色12～15min→水洗→0.5％番紅復染35s～40s→水洗→干燥→鏡檢→低倍鏡→高倍鏡→油鏡；

觀察芽孢染色結果，染色后，菌體呈微紅色，若有芽孢則芽孢呈綠色。

本發明通過對疑似生花真菌性病原菌的細胞核和子囊孢子進行染色的結果與已確認生花病害微生物進行比較，以此來對其進行鑒定。本發明方法具有實驗簡單、成本低廉、易操作實施、重復性好等優點。

具體實施方式

以下將結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。

實施例1

試驗原料和試劑

1)泡菜疑似菌：從泡菜中分離出“生花”細菌性病原疑似菌5株，編號為B₁、B₂、B₃、B₄、B₅，分離出來的菌落表面粗糙，外圍為白色整齊絲狀，中心為紅色，邊緣整齊，中央稍凸起直徑6～8mm；

2)Ehrlich蘇木精液：用25ml乙醇及10ml醋酸將2g蘇木精溶解，然后加100ml甘油，再加入其余75ml乙醇，將10g鉀明礬溶于100ml水中，加熱溶解，再將鉀明礬溶液緩慢加到蘇木精溶液中，并不時攪拌，混合后在光亮處放置3周左右，溶液呈紅色；

3)乙醇、石油醚、酸、堿等常用化學試劑。

試驗步驟：

菌懸液涂片→干燥→石油醚脫蠟→乙醇溶液沖洗→蘇木精液染色32min→水洗1lmin→酸水或酸乙醇分色→乙醇或水沖洗數小時→置堿水或堿乙醇中變藍→1.2％伊紅溶液復染→各級乙醇脫水→二甲苯透明→鏡檢；