[發明專利]基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法

有效

• 申請號: 201310371480.8
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103468635A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 賀永;夏冰;傅建中;趙朋;金育安
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N11/10;C12N11/04
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及細胞打印領域，尤其是涉及一種基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法。

背景技術

快速成型（RP）技術是九十年代發展起來的一項先進制造技術，在計算機的控制下，RP系統可以根據零件的形狀，每次制作一個具有一定微小厚度和特定形狀的截面，然后再把它們逐層粘結起來，就得到了所需制造的立體的零件。不同公司制造的RP系統所用的成形材料不同，系統的工作原理也有所不同，但其基本原理都是一樣的，那就是分層制造、逐層疊加。利用快速成型（RP）技術，可以在無需準備任何模具、刀具和工裝卡具的情況下，直接接受產品設計（CAD）數據，快速制造出新產品的樣件、模具或模型。

在生物工程領域，快速成型技術是制造支架（三維細胞支架）的一項很好的技術工具。這些基于模型的技術可以通過在工作臺上進行逐層材料沉積，得到多孔3D支架。在構造支架的過程中，每一層都是沉積成可互相滲透的纖維網絡（材料和空隙）。這樣可以構成一個具有多孔并無相連接的三維支架。一個可控的有空隙支架可以很好的給細胞和組織提供氧氣、養料保證組織培養。支架的內部和外部結構可以由CAD或CAM繪制而成。通過這些方式可以生產可替換正常組織并滿足其機械性能的3D結構。另外，利用電腦層析成像和核磁共振成像可以得到組織構造的支架。這種生產支架的多樣性可以更有利于研究細胞在不同組織支架中的再生情況。近期，利用快速成型制造可以提供細胞生長的三維結構已經可以制造出來了，其目標是可以制造等效活細胞。這項技術，有很多人稱之為組織或細胞打印，也可以被定義成多細胞群沉積技術，有望模仿活細胞進行排布。基本原理是設計一個可以更接近真實細胞、基質和生物分子組織的方法，這種方法可以幫助揭示細胞與細胞，細胞與基質關系，并且也可以為功能移植中的細胞再生提供幫助。

目前3D沉積技術對單純聚合物支架打印技術已日趨成熟，單純的打印一個符合要求的有機物支架已經不是細胞打印的主要瓶頸。但可以打印出一個可供活細胞生存并正常分化的凝膠支架尚且困難，目前常用的聚合物沉積支架主要缺點有（1）細胞和支架的制作不同步。現代細胞沉積的主要方法是先制作有機聚合物支架，再向支架中注入活細胞，其優點是保證注入活細胞成活率，但缺點是不能控制細胞在支架中的成分和比例，導致支架中細胞的含量由于支架結構的限制而分配不均；（2）細胞成活和分化有失實時性，由于無法在注入過程中實現細胞的實時監測，細胞成活與否只有在細胞完全注入并培育一段時間后，才能檢測細胞是否成活和細胞的分化情況。而當所制作支架不滿足成活條件時，需要重新制作支架并且重復實驗，這就導致真正制作一個符合要求的支架將消耗大量的時間精力。（3）成活率檢測為沉積后檢測，當細胞注入到支架的過程中，細胞可能在注入的過程死亡，這是由于在細胞被注入及到達支架預定位置的時間段內，細胞并不能得到足夠的養分，并且在這段時間里，細胞將受到不同程度的擠壓。在諸多外界因素的影響，很有可能導致細胞提前死亡，這樣的結果并不能證明支架本身的結構式有問題，對實驗結果即會產生偏差。實驗結果產生偏差會進而導致更多無效的重復制作支架過程。

發明內容

本發明提供了一種基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，在制作過程中實時對細胞成活狀態、在支架中的比例以及細胞分化情況進行檢測反饋，根據檢測數據調整三維細胞支架打印參數，進而得到精確的三維細胞支架。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案如下：

一種基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，包括：

（1）將干細胞置于活體染料的培養皿中培養染色，直至干細胞變色后，將有色干細胞和無色干細胞分離，取出有色干細胞；

（2）將染色后的有色干細胞置于凝膠原液中培養，培養完成后，加入凝膠浴液，過濾得到凝膠包裹的干細胞；

（3）將步驟（2）得到凝膠包裹的干細胞裝入三維打印裝置的注射器中，進行三維細胞支架打印，打印過程中，根據有色干細胞的分布情況實時讀取三維細胞支架上有色干細胞的分布信息，最后固化得到三維細胞支架；

（4）將得到的三維細胞支架放置20-48小時后，浸入到干細胞初期分化檢測試劑中，檢測三維細胞支架上干細胞初期分化信息；

（5）將得到的三維細胞支架放置10-15天，利用蛋白檢測設備檢測三維細胞支架上干細胞后期分化信息；

（6）最后進行如下判斷：

若制備得到三維細胞支架符合要求，則完成打印過程；