[發(fā)明專利]福爾馬林固定石蠟包埋樣本核酸萃取方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310370788.0
• 申請(qǐng)日: 2013-08-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104232616A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘挺豪;官振群;郭時(shí)鈺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 芮寶生醫(yī)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 周長(zhǎng)興

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是關(guān)于一種核酸分離方法，特別是關(guān)于一種自福爾馬林固定石蠟包埋樣本中取得核酸的核酸分離方法。

背景技術(shù)

福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed?paraffin-embedded，簡(jiǎn)稱FFPE）是目前最廣泛采用的保存病理樣本的方法。尤其對(duì)于臨床病理診斷與病理機(jī)制研究而言，福爾馬林固定石蠟包埋方法及組織樣本更是不可或缺的必要工具之一。由于生物組織樣本離體后，容易腐化難長(zhǎng)久保存，而福爾馬林固定石蠟包埋組織則提供了一完善的解決方法：經(jīng)由適當(dāng)?shù)母栺R林固定石蠟包埋，樣本得以充分保有其組織原貌，供長(zhǎng)期保存；更可經(jīng)由完善的歸檔，建構(gòu)病理樣本數(shù)據(jù)庫(kù)，病理研究人員可回溯取得組織樣本的狀態(tài)，取得更充分的病理分析信息。

一般而言，福爾馬林固定石蠟包埋組織較常應(yīng)用于臨床的病理切片，以各種組織染色方法加以處理，由直觀的顯微鏡觀察方法，診察其組織型態(tài)與特殊生物分子（例如：蛋白質(zhì)、核酸、骨質(zhì)…等）的表現(xiàn)情況，從中獲得大量信息，精確診斷或探究病理機(jī)制。然而，福爾馬林固定石蠟包埋組織除了能提供上述信息外，福爾馬林固定石蠟包埋組織中還保存了另一種藏有豐富珍貴信息的生物分子-核酸。在取得核酸后，配合進(jìn)行聚合酶連鎖反應(yīng)（PCR）、反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)（reverse?transcription-PCR或RT-PCR）、量化實(shí)時(shí)聚合酶連鎖反應(yīng)（quantitative?real?time-PCR或Q-RT-PCR）、微芯片分析（microarray）、免疫沉淀（immuno-precipitation）分析等各種分子生物學(xué)或免疫學(xué)技術(shù)的分析，測(cè)定病理組織中的基因表現(xiàn)，可更深入研究特定疾病的病理機(jī)轉(zhuǎn)與對(duì)應(yīng)的基因調(diào)控機(jī)制，對(duì)病理學(xué)的研究幫助甚深。

此外，近年來(lái)隨著基因體研究的發(fā)展，延伸開(kāi)發(fā)出「藥學(xué)基因?qū)W」（Pharmacogenomics）的領(lǐng)域。簡(jiǎn)言之，由于每一個(gè)體之間，其基因上的微小差異卻可能造成各個(gè)體對(duì)藥物的代謝反應(yīng)歧異，并導(dǎo)致截然不同的臨床癥狀。因此，將個(gè)體的基因材料（核酸），應(yīng)用至藥物測(cè)試與藥物作用機(jī)制研究，期望可針對(duì)各病患精確地偵測(cè)其對(duì)于藥物的反應(yīng)，有助于更準(zhǔn)確地確立治療方針。亦即，利用福爾馬林固定石蠟包埋組織中的材料，可將臨床征狀與個(gè)體的分子、基因表現(xiàn)的診察結(jié)果連結(jié)加以連結(jié)，提供更多且更精準(zhǔn)的診斷信息。

由此可見(jiàn)，福爾馬林固定石蠟包埋組織不僅在傳統(tǒng)的病理分析上扮演著重要角色，其亦具備了長(zhǎng)期匯集保存的優(yōu)勢(shì)，可系統(tǒng)性地提供豐富基因信息，更是未來(lái)醫(yī)藥研究的有力工具。因此，如何妥善且完整地從福爾馬林固定石蠟包埋組織中分離出核酸，便成了首要達(dá)成的目標(biāo)。

因此，為了自福爾馬林固定石蠟包埋組織中取得生物組織，在進(jìn)行實(shí)際的核酸萃取步驟的前，首要步驟便是移除包埋材料（石蠟），此步驟通常稱為「脫蠟」（Deparaffinization）。然而，目前對(duì)于福爾馬林固定石蠟包埋組織的處理方式，多數(shù)采取的前處理方法中均包含公知的有機(jī)溶劑脫蠟方法（參見(jiàn)圖1的脫蠟方法流程示意圖），簡(jiǎn)述如下：

步驟1′：二甲苯脫蠟：以純二甲苯（Xylene）溶液或系列濃度（通常為70%至100%體積百分比）的二甲苯溶液，浸潤(rùn)福爾馬林固定石蠟包埋組織，并多次置換二甲苯溶液（如采用系列濃度二甲苯溶液處理時(shí)，依序由最高濃度至較低濃度處理），以充分溶解石蠟，即可取得原包埋于石蠟中的生物組織。

步驟2′：乙醇置換：使用乙醇（100%體積百分比）浸潤(rùn)生物組織，并視需求增加置換的次數(shù)，以盡可能移除二甲苯溶液。

步驟3′：沖洗或復(fù)水（Rehydration）：是以乙醇或系列濃度乙醇（通常為70%至100%體積百分比，溶于純水）浸潤(rùn)生物組織，以更進(jìn)一步置換殘留的二甲苯溶液，可選用直接以100%乙醇置換，或依序由最高濃度至較低濃度進(jìn)行多次置換，以此充分洗去殘余的二甲苯溶液，以執(zhí)行后續(xù)核酸萃取與供核酸分析使用；此外，亦可根據(jù)使用者特定的需求與目的，將脫蠟后的組織回溶至水相溶液供后續(xù)使用。

于前述過(guò)程中，由于脫蠟后的組織是分散于溶液中，每次的置換與分離的程序均須依賴離心方法，使組織聚集于試管底，再將需要置換的溶液吸出排除。因此在繁瑣的置換、離心與液體吸取過(guò)程中，生物組織流失的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)提高，不利于核酸分離的完整度與效果；此外，一般福爾馬林固定石蠟包埋組織的采樣量通常很少，前述的繁復(fù)程序所造成的不利影響更加顯著。