[發明專利]一種基于HPLC技術的石蒜中茉莉酸類化合物含量的檢測方法

無效

• 申請號: 201310370131.4
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN103412082A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 張玉瓊;李勇;董慧;董召榮;宋賀
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

技術領域

本發明涉及一種利用高效液相法HPLC測定植物體中激素的方法，尤其涉及的是一種基于HPLC技術的石蒜中茉莉酸類化合物含量的檢測方法。

背景技術

茉莉酸類化合物是廣泛存在于植物體的一類激素，在植物體中含量甚微，目前可用于檢測植物體中的茉莉酸類激素的方法主要有：氣質聯用（GC-MS），液質聯用（HPLC-MS）和酶聯免疫檢測技術（ELISA），UPLC-MS-MS等方法，也有液相色譜電化學檢測方法（liquid?chromatography-electrochemical?detection，HPLC-ECD）。

在現有的檢測技術中，單獨的HPLC檢測法還不能夠準確且快速地檢測植物中的多種茉莉酸類激素。GC-MS檢測法，雖然靈敏性好，但測定茉莉酸類化合物時需先要進行衍生化。所采用的衍生化是酯衍生化，茉莉酸會轉變成酯類化合物，而內源茉莉酸類激素包含有茉莉酸甲酯和二氫茉莉酸甲酯等化合物，所以GC-MS方法也具有一定的局限性。酶聯免疫法檢測方法（ELISA）和液相色譜電化學檢測方法（HPLC-ECD）具有較高的特異性。但茉莉酸類化合物種類較多，ELISA法不能夠同時檢測多種激素，重復性較差；已報道的HPLC-ECD方法是將茉莉酸與多巴胺反應，生成具有電化學信號的物質，該方法只能檢測茉莉酸的含量。其他的檢測方法的步驟均復雜或對儀器設備的要求較高，不便于激素的快速準確地測定。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種基于HPLC技術的石蒜中茉莉酸類化合物含量的檢測方法，較為快速準確地同時檢測植物中四種茉莉酸類激素。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟：

（1）樣品的提取與純化

取待測樣品的新鮮植物葉10g，加入20～30ml體積濃度為80%的甲醇溶液，加入吸附劑，冰浴研磨成勻漿，離心后取上清旋轉蒸發至水相；加入磷酸鹽緩沖液，脫色后萃取，然后復溶，經Spe?C18小柱純化后，使用0.45μm濾膜過濾，濾液作為試樣溶液；

（2）檢測裝置的設定

色譜柱為Eclipse?XDB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流動相A甲醇，B?pH3.6的乙酸水溶液；等度洗脫A：B=1:1，流速為1mL/min，檢測波長235nm，柱溫為25℃，待基線平穩，進樣量為10μL；

（3）標準曲線繪制

分別準確稱取茉莉酸JA、二氫茉莉酸DJA、茉莉酸甲酯MeJA和二氫茉莉酸甲酯DMeJA的標準品，加入甲醇溶解，搖勻配制成質量濃度為1.0～1.2mg/ml的標準品溶液；分別取各標準品溶液，加甲醇逐級稀釋，制得質量濃度分別為200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml的標準系列溶液；分別精密量取10μl進樣于高效液相色譜儀，記錄色譜圖，分別以各標準品的含量x為橫坐標，以峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，橫坐標標準品的含量在5～200微克/毫升，得到標準品茉莉酸、二氫茉莉酸、茉莉酸甲酯和二氫茉莉酸甲酯的保留時間RT分別為：茉莉酸RT為4.380min，二氫茉莉酸的RT為6.256min，茉莉酸甲酯的RT為8.603min，二氫茉莉酸甲酯的RT為13.196min；

（4）檢測待測樣品石蒜組織中的茉莉酸類含量

將石蒜樣品經步驟（1）提取與純化后按照步驟（2）和步驟（3）進行HPLC檢測，進樣10μl，積分同一保留時間下的峰面積，一次性檢測得到待測石蒜樣品中四個茉莉酸類激素及其含量。

所述步驟（1）中，取新鮮植物葉10g，加入20～30ml體積濃度為80%的甲醇溶液，4℃下靜置過夜，加入交聯聚乙烯基吡咯烷酮PVPP溶液，冰浴研磨成勻漿，離心后取上清旋轉蒸發至水相；加入磷酸鹽緩沖液，然后再加入等體積的石油醚脫色，保留水相，重復三次，當醚相無顏色時調節水相的pH至8.0，然后使用等體積的乙酸乙酯進行萃取，重復兩次，合并酯相，旋轉蒸發，濃縮至干，然后加入到1ml體積濃度為60%甲醇中復溶，經Spe?C18小柱純化后，使用0.45μm濾膜過濾，濾液作為試樣溶液。

本發明相比現有技術具有以下優點：本發明的方法可以同時檢測多種茉莉酸類激素，且檢測結果可靠，各種化合物分離度較好。可以用于檢測植物體中的茉莉酸類內源激素，為研究各種茉莉酸類激素在植物生長發育和次生代謝過程中所發揮的作用，同時為植物體中茉莉酸類化合物的代謝途徑研究提供技術平臺。

附圖說明