[發明專利]一種從動物血液中提取超氧化物歧化酶的方法

無效

• 申請號: 201310369613.8
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN103436500A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 龔興國;秦勇;聶顥;韓斌;應育權
• 申請（專利權）人: 慈溪市邁康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術領域

本發明涉及一種從動物血液中提取超氧化物歧化酶的方法。

(二)背景技術

超氧化物歧化酶(SOD)是普遍存在于生物體內的一種能清除超氧陰離子自由基的金屬酶，具有抗炎癥、抗輻射、抗腫瘤等多種功能，現已被廣泛應用于醫藥、食品、保健食品和化妝品中。

目前從動物血液中提取超氧化物歧化酶的工藝流程主要是血液抗凝——用生理鹽水洗滌——低溫溶血——氯仿乙醇抽提血紅蛋白——磷酸鉀萃取——熱變性——丙酮沉淀——離子交換層析——分子篩柱層析。該工藝缺點是流程復雜，成本高昂，且氯仿、丙酮等有機溶劑具有較強的毒性，對環境具有嚴重污染，對操作人員身體亦造成不可估量的損害。

(三)發明內容

為了克服現有從動物血液中提取超氧化物歧化酶的方法的上述不足，本發明提供一種工藝簡單，成本低廉，不使用任何有機溶劑，對環保和操作人員身體健康有利的從動物血液中提取超氧化物歧化酶的方法。

本發明解決其技術問題的技術方案是：一種從動物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步驟：

A.血液分離：取動物新鮮血液，加入質量濃度為5～13％的檸檬酸鈉溶液，檸檬酸鈉溶液的體積為血液體積的5～10％，經抗凝處理后經連續流離心機離心收集紅細胞，泵入水解反應罐；

B.溶血破碎細胞：向步驟A收集的紅細胞中加入1～3倍體積的純凈水，使紅細胞完全破碎，得紅細胞溶血液；

C.熱變性：將紅細胞溶血液加熱至60℃保溫10～30分鐘后，再向紅細胞溶血液中加入用以提高溶液的離子強度的堿金屬鹽，至堿金屬鹽濃度為0.1～0.6mol/L，繼續加熱至65℃，保溫20～60分鐘后，再升溫至70～75℃，保溫15至20分鐘，立即放料冷卻；

D.壓濾：用800目濾布對經步驟C處理的紅細胞溶血液進行機械壓濾，濾液為SOD粗提液；

E.超濾濃縮：SOD粗提液先經超濾膜預處理攔截分子量大于100萬的大分子蛋白和細胞膜碎片，然后經截留分子量8000孔徑的超濾膜反復超濾，去除水分、無機鹽和小分子雜蛋白，直至濃縮到SOD粗提液體積的2％～12％，即為SOD濃縮液；

F.沉淀除雜蛋白：向步驟E所得的SOD濃縮液中加入金屬鹽，至該金屬鹽濃度為1～5mmol/L，攪拌均勻后靜置沉淀，離心去沉淀，上清液經超濾脫鹽后獲得SOD粗品。

優選的，在步驟F中，獲得的SOD粗品經離子交換層析后再經分子篩層析后獲得SOD精品。

優選的，在步驟C中，所述的堿金屬鹽為堿金屬的氯化物中的一種或幾種的混合物。

優選的，在步驟F中，所述的金屬鹽為銅鹽或鋅鹽中的一種或幾種的混合物。

優選的，在步驟B中采用高壓勻漿使紅細胞完全破碎或采用攪拌機攪拌使紅細胞完全破碎。

優選的，離子交換層析是DEAE陰離子交換層析，所用的層析填充料為DEAE-Sepharose?FF。

優選的，分子篩層析填充料是Sephadex?G-100或Sephadex?G-75，層析柱先用純凈水平衡，然后上樣，以純凈水洗脫，收集SOD活力峰。

本發明的有益效果在于：本發明徹底摒棄了氯仿、乙醇和丙酮等有機溶劑，根據SOD分子的結構特點及理化性質，采用熱變性和金屬鹽沉淀的方法，簡便的分離出具有較高活力的粗品SOD，這是對SOD生產的是革命性的改進。由于不使用任何有機溶劑，所以該方法成本低廉，更適合于工業化生產。本發明由于采用熱變性除血紅蛋白，因此可以在常溫下溶血，使操作更簡便，降低能耗。

本發明在熱變性中60℃保溫10～30分鐘后，再向紅細胞溶血液中加入NaCl、KCl等堿金屬鹽以增加溶液離子強度，使得熱變性更徹底，雜蛋白去除更完全，同時最大限度的保持原有的SOD活力，得率比傳統的氯仿乙醇法更高。堿金屬鹽在熱變性對SOD有保護作用，堿金屬鹽的加入，增加了紅細胞溶血液的離子強度，適當的離子強度可以抑制變性的血紅蛋白沉淀吸附SOD，使SOD抽提更完全，同時高鹽濃度對SOD有一定的保護作用，上述兩大優勢提高了SOD的得率。

本發明改進了原有的丙酮一次沉淀或分級沉淀的方法，因丙酮沸點低，容易揮發，在操作過程中對操作人員身體健康有嚴重影響，同時回收過程中損失大，成本高，對生產環境污染嚴重。在生產工藝中，盡可能不使用有機溶劑。我們替代的是金屬鹽沉淀雜蛋白，這樣，即降低了生產成本，有利環保和操作人員身體健康，又提高了SOD的活性。

(四)具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。

實施例一