[發(fā)明專利]一種新城疫病毒的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310369581.1
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN103602756A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設計）人: 詹愛軍;周建忠
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇博愛生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

1.一種新城疫病毒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（一）、設計引物及探針：

選取現(xiàn)有DNA序列數(shù)據(jù)庫（GENEBANK）中新城疫病毒（NDV）的核蛋白（NP）基因序列進行同源性對比，根據(jù)其保守區(qū)域，設計出針對各基因片段的引物及探針；

（二）、合成及修飾引物和探針：

下游引物及探針反向互補序列RC-Probe的5’端標記生物素，得到特異性檢測引物，探針Probe的5’-C6標記氨基，得到特異性探針，所述引物和探針序列分別為：

引物：

ND(NP基因)：201bp(198-398)

P1：5’-CCTCGTCTCAG?ACAGGGTCAA-3’，

P2：5’-CGGCACCTATAAAGCGTTTT?TG-3’，

探針及其反向互補序列：

Probe：5’-TCCTCTTGGCGATT?CCATCCGC-3’，

RC-Probe：5’-GCGG?ATGGAA?TCGCCA?AGAAGA-3’；

（三）、特異性探針通過與熒光編碼微球進行偶聯(lián)，制成特異性檢測微球（即液相芯片）；液相芯片能夠特異性識別各基因片段的PCR擴增產(chǎn)物，并通過液相芯片檢測儀讀出檢測結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新城疫病毒的檢測方法，其特征在于：設計PCR反應，其中：第一，PCR擴增產(chǎn)物是抽提帶有以上新城疫病毒核蛋白（NP）基因的質(zhì)粒，進行PCR擴增，其反應體系（50μL）如下：去核糖核酸酶水（RNase-free?water）34μL，10×TaKaRa?PCR緩沖液5μL，dNTP?mix((10mM/each)4μL，TaKaRa酶(5U/μl)2μL，P1(20μM)1μL，質(zhì)粒DNA模板2μL，P2(20μM)2μL；反應條件設定為：95℃熱啟動3分鐘；94℃變性30秒，52℃褪火1分30秒，72℃延伸1分鐘。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新城疫病毒的檢測方法，其特征在于：所述特異性探針通過與熒光編碼微球進行偶聯(lián)，制成特異性檢測微球（即液相芯片）的具體步驟為：

（1）、用0.1M?MES(pH4.5)將探針稀釋至0.2mM；

（2）、取200μL熒光編碼微球貯存液(5×106)，10000r/min離心5min，棄上清，加入50μL的0.1M?MES(pH4.5)，之后振蕩混勻再加入0.2nmol的0.2mM寡核苷酸探針，混勻；

（3）、加入10μL的10mg/mL?EDC溶液，混勻后室溫避光孵育30min，再次加入相同量的EDC繼續(xù)孵育30min；

（4）、加入1.0mL的吐溫-20(0.02%w/v)混勻洗滌，10000r/min離心10min沉淀熒光編碼微球；

（5）、棄上清后加入1.0mL的SDS（0.1%w/v）混勻洗滌后再次10000r/min離心10min沉淀熒光編碼微球，加入適量的0.1M?MES(pH4.5)，采用血球計數(shù)法進行計數(shù)，于2℃～8℃避光保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新城疫病毒的檢測方法，其特征在于：將已經(jīng)偶聯(lián)新城疫病毒核蛋白（NP）基因探針的相應熒光編碼微球與擴增產(chǎn)物進行雜交，建立新城疫病毒單一基因液相芯片檢測標準體系。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新城疫病毒的檢測方法，其特征在于：所述新城疫病毒基因液相芯片檢測體系的建立，具體步驟如下：分別取已經(jīng)偶聯(lián)新城疫病毒核蛋白（NP）基因探針的熒光編碼微球各100μL，充分混合后制備熒光編碼微球混合液，并用1.5×TMAC雜交液使每種熒光編碼微球稀釋為200個/種/μL，然后分別與一種或兩種混合的PCR或RT-PCR擴增產(chǎn)物進行雜交，建立新城疫病毒基因液相芯片檢測體系。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新城疫病毒的檢測方法，其特征在于：所述引物是以現(xiàn)有DNA序列數(shù)據(jù)庫（GENEBANK）上新城疫病毒的核蛋白（NP）基因的保守片段為靶目標，通過primer?Express軟件和primer?prere5.0軟件設計，得到新城疫病毒核蛋白（NP）基因的特異性引物。