[發(fā)明專利]甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型的分子檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310366045.6
• 申請(qǐng)日: 2013-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN103451283A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬朝芝;高長(zhǎng)斌;翟文;周貴龍;張彤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于油菜育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型的分子檢測(cè)方法及應(yīng)用。?

背景技術(shù)

利用雜種優(yōu)勢(shì)提高產(chǎn)量是國(guó)內(nèi)外油菜生產(chǎn)的重要目標(biāo)和發(fā)展方向。油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑有細(xì)胞質(zhì)雄性不育、細(xì)胞核雄性不育、自交不親和、化學(xué)殺雄等方法。細(xì)胞質(zhì)雄性不育是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑，盡管它存在保持系和恢復(fù)系的選育周期長(zhǎng)、有潛在的細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)等缺點(diǎn)。我國(guó)主要是波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育，其育成的雜交種占領(lǐng)我們油菜種植面積的60%左右；國(guó)外主要是蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育，除了德國(guó)NPZ種子公司及其股份占有公司利用MSL系統(tǒng)（具體內(nèi)容屬于該公司機(jī)密）、加拿大Bayer公司利用其具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核雄性不育系統(tǒng)選育雜交種外，其他公司基本上都是利用蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育選育雜交種。?

我們?cè)谘兄瞥鲆环N大量繁殖自交不親和系的方法（專利號(hào)：ZL200810236719.X）的基礎(chǔ)上，將自交不親和三系（自交不親和系、保持系、恢復(fù)系）雜種選育方法（傅廷棟主編，1995）簡(jiǎn)化為“兩系”（是指自交不親和系、恢復(fù)系）雜種選育方法（專利號(hào)：ZL200810236960.2）。與波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育和蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相比，自交不親和兩系雜交種選育方法具有育種程序簡(jiǎn)單、雜交種選育周期短、雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)、親本繁育程序簡(jiǎn)便、良種生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)。?

自交不親和表型鑒別在兩系雜種選育中起很重要的作用。通常用田間親和指數(shù)法來(lái)進(jìn)行判別，即在田間通過套袋自交結(jié)籽情況計(jì)算親和指數(shù)（Self-compatibility?Index,簡(jiǎn)寫為SCI，親和指數(shù)=籽粒數(shù)/花朵數(shù)），不僅費(fèi)時(shí)因而效率低下、受時(shí)間限制（必須在油菜開花后進(jìn)行），而且結(jié)果還易受環(huán)境影響。我們利用候選基因法，發(fā)展了與S-1300的自交不親和性連鎖的SCAR標(biāo)記（專利號(hào)：ZL200710053354.2）、與丙409自交不親和保持性連鎖的SCAR標(biāo)記（專利號(hào)：ZL200810047237.X）。研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜普遍存在S單倍型（Zhang等，Theor?Appl?Genet,2008,117(2):171-179），上述SCAR標(biāo)記在很多材料上檢測(cè)不到，因而應(yīng)用具有很大的局限。創(chuàng)建甘藍(lán)型油菜S單倍型的分子檢測(cè)技術(shù)，用來(lái)準(zhǔn)確鑒別自交不親和性，可解決選育自交不親和系和恢復(fù)系效率低下因而雜種配合力不高的問題、并用于自交不親和雜種純度鑒定。這些相關(guān)內(nèi)容，迄今還沒有報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用同源基因法克隆甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)（又稱S位點(diǎn)）基因，根據(jù)基因序列差異設(shè)計(jì)引物，找到可區(qū)分人工創(chuàng)建的自交不親和甘藍(lán)型油菜和天然的自交親和甘藍(lán)型油菜的S單倍型的SCAR（Sequence?characterized?amplified?regions,序列特征擴(kuò)增區(qū)域）分子標(biāo)記，應(yīng)用得到的SCAR分子標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)型油菜自交不親和表型進(jìn)行快速而又準(zhǔn)確的選擇，用于選育自交不親和系和鑒定自交不親和兩系雜種純度，以加快油菜自交不親和新品系的育成。?

具體地，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：?

申請(qǐng)人通過克隆甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)（又稱S位點(diǎn)）基因，根據(jù)基因序列差異設(shè)計(jì)引物，篩選得到一套用于鑒別甘藍(lán)型油菜自交不親和S單倍型的SCAR分子標(biāo)記組合，其包括4個(gè)SCAR分子標(biāo)記：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2，上述4個(gè)SCAR分子標(biāo)記的核苷酸序列依次如序列表SEQ?ID?NO：6，7，8，9所示。對(duì)這4個(gè)SCAR分子標(biāo)記進(jìn)行組合得到的2對(duì)雙重PCR標(biāo)記，分別是：SRK1-1+SRK-1300組合和SCR7-2+SRK-1300組合，上述雙重PCR標(biāo)記組合為共同組合使用或單獨(dú)使用，其中將上述兩個(gè)標(biāo)記共同組合的使用效果會(huì)更好。?

試驗(yàn)表明，我們利用上述分子標(biāo)記或其組合，創(chuàng)建了利用甘藍(lán)型油菜自交不親和S單倍型的SCAR分子標(biāo)記體系改良自交不親和系的方法以及用于鑒定甘藍(lán)型油菜自交不親和雜種純度的方法。?

甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型的分子檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用，其具體步驟如下：?

A、甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型分子檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)建：?