[發明專利]用于檢測BRCA1mRNA的核酸檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310365818.9
• 申請日: 2012-04-27
• 公開（公告）號: CN103451282A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 方國偉;周曉犢;王淑一
• 申請（專利權）人: 杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華;徐關壽

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種基因檢測試劑盒，采用探針實時熒光定量PCR技術，能夠對人類乳腺癌中的BRCA1表達水平進行檢測，可有效的節約檢測時間，提高檢測精度。

背景技術

乳腺癌作為女性的常見腫瘤，已成為癌癥死亡的第二大原因。其診斷主要建立在影像學檢查基礎上，缺乏實驗室特異性診斷指標，給早期診斷帶來困難，容易漏診或誤診，而手術切除又是乳腺癌首選治療方法，但是術后影響形態，美觀不佳，對患者造成較大困擾，更有部分患者因此產生的心理陰影，嚴重影響她們的生活質量。目前多認為乳腺癌應采取多種方法結合的綜合治療，原發病灶的徹底清理是乳腺癌治療的關鍵。另外早期診斷也顯得尤為重要，早發現是爭取其良好預后的關鍵。

乳腺癌1號基因(breast?cancel?susceptibility?gene1，BRCA1)是世界上第一個被發現的家族性乳腺癌抑癌基因，定位于17號染色體長臂上，由包括22個編碼外顯子和2個非編碼外顯子。目前研究發現,DNA修復是鉑類化療耐藥性產生的主要機制之一。臨床運用表明鉑類藥物的療效存在顯著的個體差異，部分患者獲益，部分患者耐藥并出現毒副作用。大量臨床研究已經證實：鉑類藥物的療效與腫瘤組織中BRCA1基因mRNA表達水平密切相關，即BRCA1基因表達水平低的患者對鉑類藥物敏感，反之表達水平高的患者表現耐藥。然而，抗微管類化療藥是作用于細胞微管，通過影響紡錘體形成，從而抑制細胞有絲分裂的。這類藥物時常出現治療有效率低和副作用大的問題，而且存在顯著的個體差異。大量的臨床研究顯示，抗微管藥物的療效與腫瘤組織中BRCA1基因的mRNA表達水平密切相關，即BRCA1基因表達水平高的患者對抗微管類藥物敏感，反之表達水平低的患者表現耐藥。因而，BRCA1表達水平對于后期的用藥有很重要的指導作用。

在實際應用中，用于檢測BRCA1表達的方法主要為免疫組化，盡管該法較為直觀，但是試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，且試驗結果需要經驗豐富的專家來判讀，判讀結果存在較大的主觀性，一定程度上限制了該法的應用。正是因為免疫組化法存在這些問題，才促使我們探索新的方法來檢測BRCA1表達水平。

實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性,而且能對PCR進行實時在線檢測,反應BRCA1在組織中的初始含量，試驗節約了大量的檢測時間,還避免了遺留污染的發生。常見的方法有SYBR?GreenI染料法,雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBR?GreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本發明采用實時熒光PCR技術結合Taqman探針法應用于BRCA1基因檢測。

發明內容

鑒于現有技術中檢測BRCA1的不足，本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術檢測BRCA1基因。通過調整兩個基因的引物探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發了一種用于檢測BRCA1mRNA的核酸檢測試劑盒。

用于檢測BRCA1mRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于：

檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、d?NTP、Mg²⁺、檢測用上下游引物BRCA1-F/BRCA1-R和探針BRCA1-Probe、參照用上下游引物Actin-F/Actin-R探針Actin-Probe；其中，

BRCA1-F：CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA

BRCA1-R：GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT

BRCA1-Probe：FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA

Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT

Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT

Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。

進一步地，檢測用上下游引物和探針的比例優選為：BRCA1-F︰BRCA1-R︰BRCA1-Probe的摩爾比為2︰2︰1。

參照用上下游引物和探針的比例優選為：Actin-F︰Actin-R︰Actin-Probe的摩爾比為2︰2︰1。

所述陽性對照品為含有BRCA1基因組的溶液；所述陰性對照品為無BRCA1基因組的溶液。