[發(fā)明專利]嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310365079.3
• 申請(qǐng)日: 2012-01-05
• 公開（公告）號(hào): CN103468695B
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李元躍;王雷;段博文;陳融斌;黎中寶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 集美大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 泉州市誠(chéng)得知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)35209
• 代理人: 尤懷成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病病原菌——嗜水氣單胞菌，特別涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）在自然界分布廣泛，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，可產(chǎn)生多種致病因子，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物，畜禽和人類均有致病性，可引起多種動(dòng)物的敗血癥和人類腹瀉，給人類健康帶來了威脅，同時(shí)也給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失（1.張翠娟，于宙亮，趙寶華，何宏軒．嗜水氣單胞菌研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008,42（7）：46-50.）。因此，對(duì)于作為水源污染指示菌的嗜水氣單胞菌污染，其檢測(cè)力度仍需進(jìn)一步加強(qiáng)。目前嗜水氣單胞菌的檢測(cè)一直是個(gè)棘手的問題，傳統(tǒng)的化學(xué)病理檢測(cè)過程繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間；酶聯(lián)免疫、多重PCR技術(shù)則成本過高（2.王利．魚類嗜水氣單胞菌的幾種檢測(cè)方法[J]．內(nèi)陸水產(chǎn)，2006,（2）：22-23．）。因此，開發(fā)一種操作簡(jiǎn)便，成本低廉，快速方便的嗜水氣單胞菌檢測(cè)方法，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切需要解決的技術(shù)難題。

SELEX( Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，是1990年由美國(guó)的Tuerk和Gold創(chuàng)建的一種體外合成篩選寡核苷酸適體的化學(xué)組合技術(shù)（3.孟慶玲，陳創(chuàng)夫．SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J]．塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20(3):44-48． 4.廖世奇，劉巍，王黎．SELEX技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．甘肅醫(yī)藥，2009，(02)：96-97．）。由于適體具有特異性高、庫(kù)容量大、合成時(shí)間短（5.王聰艷，孫偉，李建國(guó)，等．SELEX技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．生物技術(shù)通報(bào) ，2006，(S1)：232-236．）等優(yōu)點(diǎn)， SELEX技術(shù)現(xiàn)在廣泛應(yīng)用在疾病防控、藥物篩選、臨床診斷等不同的技術(shù)領(lǐng)域，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，逐漸產(chǎn)生了一些新的SELEX篩選方法，如導(dǎo)向SELEX技術(shù)、復(fù)合靶分子SELEX技術(shù)、基因組SELEX技術(shù)等新的研究手段（6.孟慶玲，陳創(chuàng)夫．SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J]．塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20(3):44-48．）。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供嗜水氣單胞菌適體。

本發(fā)明的第二目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法。

本發(fā)明的第三目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體在檢測(cè)述嗜水氣單胞菌中的應(yīng)用。

所述嗜水氣單胞菌適體的核酸序列如序列表中1-22號(hào)中的序列所示。

所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法是將指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（即SELEX 篩選）應(yīng)用于嗜水氣單胞菌適體的篩選，所述SELEX 篩選的具體步驟包括：

1）構(gòu)建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫(kù)，并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的引物；

2）取適量所述ssDNA文庫(kù)與嗜水氣單胞菌進(jìn)行結(jié)合；

3）分離獲得與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA，以該ssDNA為模板進(jìn)行PCT擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再次進(jìn)行SELEX 篩選直至獲得相應(yīng)適體。

在步驟1）中，所述ssDNA文庫(kù)可為：：5′-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3′。

所述引物可為：

引物Ⅰ：5′-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3′；

引物Ⅱ：5′-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3′；

引物Ⅲ：5′-地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3′；

引物Ⅳ：5′-生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3′。

在步驟3）中，所述SELEX 篩選共進(jìn)行12輪。

本發(fā)明采用SELEX技術(shù)篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體為嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)以及在水產(chǎn)病害控制方面的應(yīng)用提供參考，可廣泛應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的檢測(cè)與分析。

附圖說明

圖1為 PCR產(chǎn)物3%瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖1中，M為50bp DNA marker，1、3、5、7、9、11、12分別表示第1、3、5、7、9、11、12輪的PCR產(chǎn)物。

圖2為適體與嗜水氣單胞菌結(jié)合的吸光度。在圖2中，橫坐標(biāo)為篩選輪數(shù)，縱坐標(biāo)為A450nm時(shí)的吸光度。