[發明專利]一種促進有機酸分泌的溶磷基因

無效

• 申請號: 201310365037.X
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN103409436A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 龔明波
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/11;C12P7/54;C12P7/40;C12P7/46;C12P7/50;C07K14/385;C09K17/14;C09K101/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種促進有機酸分泌的溶磷基因。

背景技術

產生有機酸是溶磷微生物釋放土壤難溶磷的一種主要的方式，有機酸與土壤中鐵、鋁、鈣等離子螯合，從而使難溶磷轉化為有效磷，提高磷肥利用率。溶磷微生物產生比較常見的有機酸有琥珀酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、有機酸、甲酸、丙酸、富馬酸和草酸。而溶磷微生物的應用受到如菌株的退化、作物種類、土壤特性、氣候條件、溶磷菌與其它微生物間的交互作用等影響而效果不穩定。高效利用溶磷微生物產生有機酸或者通過異源表達克隆到的溶磷相關基因產生有機酸是提高土壤磷素利用率最有效的一種方式，而其關鍵是溶磷相關基因的獲得。

關于溶磷相關基因研究以細菌為主，其主要機制是將葡萄糖直接氧化產生葡萄糖酸(GA)，其中葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脫氫酶(GDH)和協同因子吡咯喹啉奎寧（PQQ）完成（Goldstein?AH，1999，FEMS?Microbiology?Ecology,30(4):295-300.）。目前關于真菌溶磷相關基因的克隆也有報道，主要是以黑曲霉和草酸青霉為主，但其數量非常少，主要機制也不是很明確，也有報道從草酸青霉中克隆到的基因編碼合成蘋果酸脫氫酶在大腸桿菌中表達，分泌蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、草酸等有機酸從而使難溶磷溶解（Lü?J?2011,Annals?of?Microbiology,1-8）。

目前，在ncbi數據庫中發布了真菌Penicillium?decumbens114-2Contig69的全基因組序列（gb|AGIH01000069），但未對基因的功能進行預測與分析。在ncbi數據庫中，van?den?Berg?MA等在ncbi數據庫中發布了工業生產青霉素的真菌Penicillium?chrysogenum的全基因組序列（2008,Nat?Biotechnol26(10):1161-8），與本發明基因編碼的蛋白同源性最高，為90%，對其功能也未進行預測，同時，其它同源性較高的蛋白都為假定蛋白酶體調節顆粒（Proteasome?regulatory?particle），其主要作用是調節降解細胞不需要的或受到損傷的蛋白質。沒有報道與本發明同源性較高的基因或蛋白具有促進宿主菌大量產有機酸的功能。

發明內容

本發明的目的是提供一種溶磷基因，促進有機酸分泌，具有將難溶磷轉化為有效磷提高磷肥利用率的效果。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種溶磷基因psg?I-13，所述溶磷基因psg?I-13的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

本發明還提供了一種由所述溶磷基因psg?I-13編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明還提供了含有所述溶磷基因的載體。

作為優選，所述載體為表達載體pET28a。

本發明還提供了含有所述溶磷基因的工程菌。

作為優選，所述工程菌為E.coli?HST08。

本發明還提供了用于擴增溶磷基因psg?I-13的開放閱讀框序列的引物對，包括正向引物F：5'-TATTCGGAATTCATGACAGACCTCAAGTCCAT-3'和反向引物R：5'-CAAGTACTCGAGTTAAACGATAGTCTCTAGCTC-3'；

其中，溶磷基因psg?I-13的開放閱讀框序列為：

SEQ?ID?No.3所示的核苷酸序列。

本發明還提供了溶磷基因psg?I-13在促進有機酸分泌中的應用。

本發明從草酸青霉菌I1(Penicillium?oxalicum?I1)基因組中克隆獲得，其氨基酸序列通過DNAMAN分析后獲得。

具體地說，本發明利用SMART技術構建草酸青霉菌I1的初級cDNA文庫，通過難溶磷培養基篩選具有溶磷透明圈的轉化子，對篩選出的轉化子進行測序分析，獲得其cDNA序列。利用軟件DNAMAN對cDNA序列結構進行分析，獲得其開放閱讀框，其序列如序列表SEQ?ID?NO.3所示，根據序列，設計并合成上下游寡核苷酸引物，以篩選的轉化子攜帶的質粒為模板，進行擴增，將開放閱讀框部分序列連接到pET28a(+)載體上，導入大腸桿菌，在大腸桿菌中表達，分泌乙酸、甲酸、蘋果酸和α-酮戊二酸。

本發明還提供了溶磷基因psg?I-13在溶解無機難溶磷中的應用。