[發明專利]一種復合種子細胞的組織工程神經的制備方法

有效

• 申請號: 201310364793.0
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN103446628A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 樊立宏;王坤正;黨曉謙;余澤鋒
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36;C12N5/0775
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

1.一種復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，包括以下操作：

1）取離體的異種動物的外周神經組織，剔除其中的神經外血管、脂肪及結締組織之后，用胰蛋白酶處理；胰蛋白酶處理完成后終止消化，使用低滲處理液對神經組織進行低滲處理；

2）將低滲處理后的神經組織在SB-10溶液中震蕩浸泡12h以上，清洗后轉入含有Triton?X200和SB-16的混合液中震蕩浸泡12h以上，清洗后得到脫細胞神經基質；

3）用含體積分數10～20%的胎牛血清和1～5μmol／Lβ-巰基乙醇的DMEM-F12培養基預誘導傳代后的骨髓間充質干細胞12～24h，無菌沖洗，然后培養基更換為含質量分數1～2%二甲基亞砜和體積分數10～20%的胎牛血清的DMEM-F12培養基，誘導培養12～24h；

4）將脫細胞神經基質用DMEM-F12培養基充分浸潤，吸干培養基后37℃孵育，然后接種誘導培養后的神經誘導骨髓間充質干細胞，添加DMEM-F12培養，并補充胎牛血清至體積分數為10～20%，于37℃、5%CO₂、95%濕度的條件下培養48小時，得到復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經。

2.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的外周神經組織是在顯微鏡下仔細剔除神經外血管、脂肪及結締組織；然后加入質量分數0.25%的胰蛋白酶，37℃下、以80～100次/分鐘的頻率震蕩水浴20～30分鐘；

傾去胰蛋白酶，PBS清洗終止胰蛋白酶消化，然后去離子水，25℃下、以80～100次/分鐘的頻率震蕩水浴3～4小時；再將低滲處理后的神經組織轉入滅菌的PBS溶液中潤洗。

3.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的低滲處理后的神經組織是在SB-10溶液、含有Triton?X200和SB-16的混合液交替多次循環處理之后，獲得脫細胞神經基質。

4.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的低滲處理后的神經組織是在濃度為100～150mmol/L?SB-10溶液中，在25℃下、以80～100次/分鐘的頻率震蕩水浴12～15小時，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗；

清洗后次轉入含有質量濃度0.14～0.20%的Triton?X200和0.6～0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25℃下、以80～100次/分鐘的頻率震蕩水浴12～24小時，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗；

清洗后第二次轉入濃度為100～150mmol/L?SB-10溶液中，在25℃下、以80～100次/分鐘的頻率震蕩水浴5～10小時，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗；

清洗后第二次轉入含有質量濃度0.14～0.20%的Triton?X200和0.6～0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25℃下、以80～100次/分鐘的頻率震蕩水浴10～15小時，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗，獲得脫細胞神經基質，4℃保存。

5.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的骨髓間充質干細胞的制備及傳代培養為：

取骨髓組織，使用含青霉素、鏈霉素各100U/ml的DMEM-F12培養基，沖洗吹打制成單細胞懸液，將細胞懸液和Percoll分離液混合后離心，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM-F12培養基重懸細胞，計數5×10⁵個/ml后即接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO₂、95%濕度的培養箱中進行原代培養，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次；

待細胞長滿瓶底80%時進行傳代培養，以1×10⁴個/ml傳代。