[發(fā)明專利]嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310364383.6
• 申請日: 2012-01-05
• 公開（公告）號(hào): CN103468687A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李元躍;王雷;段博文;陳融斌;黎中寶
• 申請（專利權(quán)）人: 集美大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廈門市誠得知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 35209
• 代理人: 尤懷成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病病原菌——嗜水氣單胞菌，特別涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

嗜水氣單胞菌（Aeromonas?hydrophila）在自然界分布廣泛，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，可產(chǎn)生多種致病因子，對水產(chǎn)動(dòng)物，畜禽和人類均有致病性，可引起多種動(dòng)物的敗血癥和人類腹瀉，給人類健康帶來了威脅，同時(shí)也給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失（1.張翠娟，于宙亮，趙寶華，何宏軒．嗜水氣單胞菌研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志，2008,42（7）：46-50.）。因此，對于作為水源污染指示菌的嗜水氣單胞菌污染，其檢測力度仍需進(jìn)一步加強(qiáng)。目前嗜水氣單胞菌的檢測一直是個(gè)棘手的問題，傳統(tǒng)的化學(xué)病理檢測過程繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間；酶聯(lián)免疫、多重PCR技術(shù)則成本過高（2.王利．魚類嗜水氣單胞菌的幾種檢測方法[J]．內(nèi)陸水產(chǎn)，2006,（2）：22-23．）。因此，開發(fā)一種操作簡便，成本低廉，快速方便的嗜水氣單胞菌檢測方法，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切需要解決的技術(shù)難題。

SELEX(?Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment)即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，是1990年由美國的Tuerk和Gold創(chuàng)建的一種體外合成篩選寡核苷酸適體的化學(xué)組合技術(shù)（3.孟慶玲，陳創(chuàng)夫．SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J]．塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20(3):44-48．?4.廖世奇，劉巍，王黎．SELEX技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．甘肅醫(yī)藥，2009，(02)：96-97．）。由于適體具有特異性高、庫容量大、合成時(shí)間短（5.王聰艷，孫偉，李建國，等．SELEX技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．生物技術(shù)通報(bào)?，2006，(S1)：232-236．）等優(yōu)點(diǎn)，?SELEX技術(shù)現(xiàn)在廣泛應(yīng)用在疾病防控、藥物篩選、臨床診斷等不同的技術(shù)領(lǐng)域，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，逐漸產(chǎn)生了一些新的SELEX篩選方法，如導(dǎo)向SELEX技術(shù)、復(fù)合靶分子SELEX技術(shù)、基因組SELEX技術(shù)等新的研究手段（6.孟慶玲，陳創(chuàng)夫．SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J]．塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20(3):44-48．）。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供嗜水氣單胞菌適體。

本發(fā)明的第二目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法。

本發(fā)明的第三目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體在檢測述嗜水氣單胞菌中的應(yīng)用。

所述嗜水氣單胞菌適體的核酸序列如序列表中1-22號(hào)中的序列所示。

所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法是將指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（即SELEX?篩選）應(yīng)用于嗜水氣單胞菌適體的篩選，所述SELEX?篩選的具體步驟包括：

1）?構(gòu)建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的引物；

2）?取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進(jìn)行結(jié)合；

3）??分離獲得與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA，以該ssDNA為模板進(jìn)行PCT擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再次進(jìn)行SELEX?篩選直至獲得相應(yīng)適體。

在步驟1）中，所述ssDNA文庫可為：：5′-GGG?AGC?TCA?GAA?TAA?ACG?CTC?AA-N35-TT?CGA?CAT?GAG?GCC?CGG?ATC-3′。

所述引物可為：

引物Ⅰ：5′-GGG?AGC?TCA?GAA?TAA?ACG?CTC?AA-3′；

引物Ⅱ：5′-GAT?CCG?GGC?CTC?ATG?TCG?AA-3′；

引物Ⅲ：5′-地高辛-GGG?AGC?TCA?GAA?TAA?ACG?CTC?AA-3′；

引物Ⅳ：5′-生物素-GAT?CCG?GGC?CTC?ATG?TCG?AA-3′。

在步驟3）中，所述SELEX?篩選共進(jìn)行12輪。

本發(fā)明采用SELEX技術(shù)篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體為嗜水氣單胞菌的快速檢測技術(shù)的開發(fā)以及在水產(chǎn)病害控制方面的應(yīng)用提供參考，可廣泛應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的檢測與分析。

附圖說明

圖1為?PCR產(chǎn)物3%瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖1中，M為50bp?DNA?marker，1、3、5、7、9、11、12分別表示第1、3、5、7、9、11、12輪的PCR產(chǎn)物。

圖2為適體與嗜水氣單胞菌結(jié)合的吸光度。在圖2中，橫坐標(biāo)為篩選輪數(shù)，縱坐標(biāo)為A450nm時(shí)的吸光度。