[發(fā)明專利]一種適用于多種生物的檢測PCR反應假陰性的引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310364064.5
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103409548A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設計）人: 蔣國成;陳旭;陳剛;吳小祝
• 申請（專利權）人: 蘇州吉泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海卓陽知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 巫蓓麗

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，具體地說，涉及一種適用于多種生物的檢測PCR反應假陰性的引物。

背景技術

PCR技術即聚合酶鏈式反應，用于放大特定的DNA片段，是現(xiàn)代分子生物研究的基礎技術之一，已廣泛應用于感染性疾病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、法醫(yī)學、動植物和考古等的診斷和研究中。PCR技術有著靈敏度高、特異性強、快速簡便的優(yōu)點，但是也有其局限性，導致結果不是非常可靠性，其中常見的是假陽性和假陰性的問題。

假陽性是指不含目的片段的模板經(jīng)過PCR，擴增出了與目的模板大小差不多的片段，給人一種含有目的片段的假象。假陰性是指模板中含有目的片段，但由于實驗各方面的原因，沒有擴增出目的條帶，讓人誤以為是陰性，所以叫假陰性，說明PCR反應體系中存在抑制物。

PCR的假陽性問題深受重視，假陰性則相對重視不夠，但PCR假陰性問題相對于某些方面更為嚴重，比如臨床檢測中大三陽檢出率低，假陰性就是“罪魁禍首”，可見假陰性問題的嚴重性。實際上PCR假陽性的問題是比較單純的，一般僅涉及反應體系污染和引物的特異性問題，都可以很好地解決。而PCR的假陰性問題卻不同，它涉及了參與PCR實驗的幾乎所有人員和技術環(huán)節(jié)，十分復雜，包括儀器因素、試劑因素、模板因素、操作人員素質(zhì)及其他因素，很難找到具體原因，較難排查。

因而若能夠有一條大小合適的DNA片段作為指示條帶，針對該指示條帶設計一對特異性強、靈敏度高的引物，直接檢測PCR反應是否受抑制即是否存在假陰性問題，使結果真實可靠，顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種引物。

本發(fā)明的再一的目的是，提供上述引物的用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：

一種引物，所述的引物包含序列如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。

為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：

如上所述的引物在檢測PCR反應是否為假陰性反應中的用途，所述的PCR反應其DNA模板包含SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，例如DNA模板是人、大鼠、小鼠、兔、牛、豬、狗、猴或雞全基因組DNA。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

本發(fā)明提供了一對可以特異性擴增人、大鼠、小鼠、兔、牛、豬、狗、猴、雞等多種生物全基因組DNA中152bp?DNA片段的引物，該引物特異性強、靈敏性高、實驗重復性好。以該引物為對照，可以檢測以人、大鼠、小鼠、兔、牛、豬、狗、猴、雞全基因組DNA為模板的PCR反應是否為假陰性，使PCR結果更有說服力，尤其針對目前臨床上易于出現(xiàn)假陰性的疾病診斷，本發(fā)明更是為疾病的確診提供了保障。該引物可用于制備成試劑盒，為科學研究和臨床診斷排除PCR假陰性提供便利。

附圖說明

附圖1是使用本發(fā)明的引物，分別以人、大鼠全基因組DNA為模板擴增152bp?DNA目的指示條帶的電泳圖譜。M泳道是NEB的100bp?DNA?Ladder，從下到上分別是100bp、200bp、300bp、400bp、500bp（加亮）、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp（加亮）、1200bp、1517bp；泳道1、2分別是以人、大鼠全基因組DNA為模板的152bp?DNA目的指示條帶擴增產(chǎn)物。

附圖2是使用本發(fā)明的引物，分別以人、大鼠、小鼠、兔、牛、豬、狗、猴、雞9種生物全基因組DNA為模板擴增152bp?DNA目的指示條帶的電泳圖譜。M泳道是NEB的100bp?DNA?Ladder，從下到上分別是100bp、200bp、300bp、400bp、500bp（加亮）、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp（加亮）、1200bp、1517bp；泳道1-9分別是以人、大鼠、小鼠、兔、牛、豬、狗、猴、雞全基因組DNA為模板的152bp?DNA目的指示條帶擴增產(chǎn)物。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1

1、引物設計

選擇多種生物保守序列中的一段152bp?DNA序列（SEQ?ID?NO.1），針對該序列設計一對PCR擴增引物，命名為ECP-F和ECP-R。其具體序列為：

ECP-F（SEQ?ID?NO.2）：5’-?TTCTTGATCGGGTTTGGGGG?-3’；

ECP-R（SEQ?ID?NO.3）：5’-?CAGCTGCCTCTTTCAATGCC?-3’。